Abrir o menú principal
Esquema dunha unión de Holliday na que se mostra a secuencia de bases e a súa estrutura secundaria pero non a terciaria. A secuencia que se mostra é só unha das moitas posibles. Esta é unha unión de Holliday inmóbil porque as secuencias non son siméricas.

Unha unión de Holliday (do inglés Holliday junction, HJ) é unha estrutura de ácido nucleico ramificada na que están unidos catro dominios de dobre cadea de ácido nucleico. En bioloxía, as unións de Holliday funcionan como intermediarios na recombinación xenética; estas unións ou cruzamentos (junctions) teñen xeralmente unha secuencia simétrica, polo que son móbiles. As unións de Holliday inmóbiles foron creadas artificialmente polos científicos inicialmente para estudar as súas estruturas como modelo das unións de Holliday, pero posteriormente atoparon un uso como materiais de construción estruturais básicos en nanotecnoloxía do ADN. A estrutura recibe o seu nome por Robin Holliday, que propuxo a súa existencia en 1964.

Índice

EstruturaEditar

Estrutura molecular dunha unión de Holliday amontoada (stacked), na cal os seus catro brazos se amontoan en dous dominios de dobre hélice. Nótese como as febras azul e vermella permanecen aproximadamente helicoidais, mentres que as febras verdes e amarelas se cruzan entre os dous dominios.
Estrutura molecular dunha unión de Holliday non amontoada (unstacked). Esta conformación carece de amontoamento de bases entre os dominios de dobre hélice, e é estable só en solucións que carecen de ións metálicos divalentes como o Mg2+. De PDB 3CRX.


 
Diagramas esquemáticos dos isómeros conformacionais con amontoamento de tres bases da unión de Holliday. Os dous confórmeros amontoados difiren nos conxuntos concretos de dous brazos que se unen por amontoamento coaxial (coaxial stacking): á esquerda, os amontoamentos son vermellos-azuis e cián-maxenta, e á dereita os amontoamentos son vermello-cián e azul-maxenta. As bases máis próximas ao punto de unión determinan que isómero amontoado domina.

As unións de Holliday poden existir en forma de varios isómeros conformacionais con diferentes patróns de amontoamento coaxial (coaxial stacking)[1] entre os catro dominios de dobre hélice. O amontoamento coaxial é a tendencia dos extremos romos (é dicir, non coherentes) de ácidos nucleicos de unirse un con outro debido a interaccións entre os aneis das bases expostas. Hai tres posibles confórmeros de amontoamento: unha forma non amontoada (unstacked) e dúas amontoadas (stacked). A forma non amontoada domina en ausencia de catións divalentes como o Mg2+ debido á repulsión electrostática entre os esqueletos cargados negativamente das febras, mentres que en presenza de polo menos un 0,1 mM de Mg2+ a repulsión electrostática é contrarrestada e predomina a estrutura amontoada. En 2000, non se coñecía con certeza se o apantallamento electrostático era o resultado da unión específica de sitio de catións á unión de Holliday, ou da presenza dunha colección difusa de ións en solución.[2]

A forma non amontoada é unha conformación estendida case plana e cadrada. Por outra parte, os confórmeros amontoados teñen dous dominios en dobre hélice continuos separados por un ángulo duns 60° cara á dereita. Dúas das catro febras permanecen aproximadamente helicoidais, e quedan dentro dos dous dominios en dobre hélice, mentres que os outros dous cruzan entre os dous dominios en disposición antiparalela.[2]

As dúas formas amontoadas posibles diferéncianse nas identidades que teñan os pares de brazos que están amontoados un sobre o outro, e cal domine dependerá en gran medida das secuencias de bases próximas á unión. Algunhas secuencias dan lugar a un equilibrio entre os dous confórmeros, mentres que outras prefiren claramente un só confórmero. En concreto, as unións que conteñen a secuencia A-CC que fai de ponte no punto de unión parecen preferir claramente o confórmero que permite que se forme un enlace de hidróxeno entre a segunda citosina e un dos fosfatos do punto de unión. Aínda que a maioría dos estudos enfocáronse a estudar as identidades das catro bases próximas á unión en cada brazo, é evidente que as bases que están máis lonxe poden tamén afectar ás conformacións amontoadas observadas.[2]

En unións con secuencias simétricas, o punto de ramificación é móbil e pode migrar nun proceso aleatorio. A velocidade de migración da rama varía drasticamente coa concentración de ións, e os tempos para dar un só paso increméntanse desde 0,3−0,4 milisegundos (ms) sen ningún ión a 270−300 ms con 10 mM de Mg2+. O cambio na velocidade está correlacionado coa formación de estruturas amontoadas ou non amontoadas.[2]

As unións de Holliday cunha amosega ou rotura nunha das febras, no punto de unión adoptan unha orientación perpendicular, e sempre prefiren o confórmero amontoado que sitúa a amosega nunha febra que sobrecruza en vez de na febra helicoidal.[2]

As unións de Holliday de ARN coñécense nalgúns ARNs biolóxicos funcionais, como o ARN espliceosomal U1 e no ribocima forquita do virus da mancha anular do tabaco. As unións de Holliday de ARN adoptan unha conformación amontoada antiparalela a altas concentracións de magnesio, unha conformación amontoada perpendicular a concentracións moderadas, e rotan nunha conformación amontoada paralela a baixas concentracións, mentres que mesmo pequenas concentracións de ión calcio (Ca2+) favorecen o confórmero antiparalelo.[2]

Función biolóxicaEditar

 
As dúas vías da recombinación homóloga en eucariotas, nas que se mostra a formación e resolución de unións de Holliday.

A unión de Holliday é un intermediario clave na recombinación homóloga, un proceso biolóxico que incrementa a diversidade xenética ao intercambiar xenes entre dous cromosomas, e tamén en eventos de recombinación específica de sitio nos que interveñen integrases. Ademais, están implicadas na reparación de roturas de dobre febra.[2] Adicionalmente, poden orixinarse estruturas cruciformes que implican as unións de Holliday para aliviar a tensión na hélice en secuencias simetricas en ADN superenrolado.[3] Aínda que as unións de catro brazos tamén aparecen en moléculas de ARN funcionais, estas xeralmente conteñen nucleótidos non apareados situados entre os dominios de dobre hélice apareados, e non adoptan estritamente a estrutura de Holliday.[2]

As unións de Holliday na recombinación homóloga están entre secuencias idénticas ou case idénticas, o que leva a un arranxo simétrico de secuencias arredor da unión central. Isto permite que ocorra un proceso de migración da rama, no que as febras se moven a través do punto de unión.[2] A clivaxe (corte) ou a resolución da unión de Holliday pode ocorrer de dúas maneiras. A clivaxe do conxunto orixinal de febras orixina dúas moléculas que poden presentar conversión xénica pero non sobrecruzamento cromosómico, mentres que a clivaxe do outro conxunto de dúas febras causa que as moléculas recombinantes resultantes presenten sobrecruzamento. Todos os produtos, independentemente da súa clivaxe, son heterodúplex na rexión da migración da unión de Holliday.[4]

Moitas proteínas poden recoñecer ou distorsionar a estrutura da unión de Holiday. Unha desas clases contén encimas que resolven a unión que se encargan de clivar as unións, ás veces dun modo específico de secuencia. Ditas proteínas distorsionan a estrucura da unión de varios modos, a miúdo empurrando a unión a adoptar unha conformación non amontoada (unstacked), rompendo os pares de bases centrais, e/ou cambiando os ángulos entre os catro brazos. Outras clases son as proteínas de migración da rama, que incrementan a velocidade de intercambio en varias ordes de magnitude, e as recombinases específicas de sitio.[2] En procariotas, as resolvases da unión de Holliday poden pertencer a dúas familias, integrases e nucleases, que son cada unha delas estruturalmente similares, aínda que as súas secuencias non están conservadas.[4]

En eucariotas, hai dous modelos principais para explicar como a recombinación homóloga repara as roturas de dobre febra no ADN, que son a vía de reparación de roturas de dobre febra (DSBR) (ás veces chamado modelo de unión de Holliday dobre) e a vía de aliñamento (annealing) de febras dependente de síntese (SDSA).[5] No caso de rotura de dobre febra, o extremo 3' é degradado e o extremo 5' máis grande invade a cromátide irmá contigua, formando unha burbulla de replicación. A medida que a burbulla se achega ao ADN roto, a febra antisentido 5' máis longa invade de novo a febra sentido desta porción do ADN, transcribindo unha segunda copia. Cando remata a replicación, ambas as colas son reconectadas para formar dúas unións de Holliday, que son despois clivadas por proteínas de variadas maneiras.[6] Unha animación deste proceso pode verse aquí.[7]

As roturas no ADN de dobre febra en bacterias son reparadas pola vía RecBCD de recombinación homóloga. As roturas que ocorren soamente nunha das dúas febras do ADN, e que se coñecen como ocos (gaps) de febra simple, crese que son reparados pola vía RecF. Tanto a vía RecBCD coma a RecF inclúen unha serie de reaccións coñecidas como migración da rama, na cal as febras de ADN sinxelas se intercambian entre dúas moléculas entrecruzadas de ADN dúplex, e tamén a resolución, na cal as dúas moléculas de ADN que se entrecruzaran son cortadas e restauradas ao seu estado normal de dobre febra.[8] A recombinación homóloga ocorre en varios grupos de virus. En virus de ADN como os herpesvirus, a recombinación ocorre por medio dun mecanismo de rotura e reunión como en bacterias e eucariotas.[9] En bacterias, a migración de rama está facilitada polo complexo RuvABC ou a proteína RecG, que son motores moleculares que usan a enerxía da hidrólise doATP para mover a unión. A unión debe despois ser resolta en dous dúplex separados, restaurando a configuración parental ou unha configuración sobrecruzada. A resolución pode ocorrer de maneira horizontal ou vertical durante a recombinación homóloga, dando lugar a produtos parche (se están na mesma orientación durante a reparación das roturas de dobre febra) ou a produtos de empalme (se están en diferentes orientacións durante a reparación de roturas de dobre febra).[10][11] RuvA e RuvB son proteínas da migración da rama, mentres que RuvC é un encima que resolve a unión.[2]

Hai tamén probas de recombinación nalgúns virus de ARN, especificamente en virus de ARN monocatenario de sentido positivo como os retrovirus, picornavirus, e coronavirus. Hai controversia sobre se a recombinación homóloga ocorre en virus de ARN monocatenario de sentido negativo como o da gripe.[12]

Uso en nanotecnoloxía do ADNEditar

 
Este complexo supramolecular de dobre sobrecruzamento (DX) contén dúas unións de Holliday entre os dous dominios de dobre hélice, nas partes superior e inferior desta imaxe. Esta baldosa pode formar matrices bidimensionais.[13]
 
Diagramas dun complexo de triángulo de integridade tensional que contén tres unións de Holliday, tanto en illamento coma formando parte dun cristal. Ademais da matriz bidimensional mostrada, esta estrutura pode formar cristais tridimensionais.
Artigo principal: Nanotecnoloxía do ADN.

A nanotecnoloxía do ADN é o deseño e manufactura de estruturas de ácido nucleico artificiais utilizadas como material de enxeñaría para nanotecnoloxía en vez de como portadores da información xenética nas células vivas. Neste campo utilízanse estruturas de ADN ramificadas como compoñentes fundamentais para crear estruturas deseñadas racionalmente máis complexas. As unións de Holliday son compoñentes de moitas destas estruturas de ADN. Como os complexos de unións de Holliday illados son demasiado flexibles para ensamblarse en matrices (arrays) ordenadas grandes, os motivos estruturais con moitas unións de Holliday utilízanse para crear "baldosas" ríxidas que poden despois ensamblarse en "matrices" máis grandes.[14][15]

O motivo deste tipo máis común é o complexo de dobre sobrecruzamento (DX), que contén dúas unións de Holliday en estreita proximidade unha da outra, que dá lugar a unha estrutra ríxida que pode autoensamblarse en matrices máis grandes. A estrutura da molécula DX forza ás unións de Holliday a adoptar unha conformación cos dominios en dobre hélice situados directamente lado con lado, en contraste co seu ángulo preferido de aproximadamente 60°. O complexo pode teoricamente ser deseñado para forzar as unións a ter unha orientación paralela ou antiparalela, pero na práctica as variedades antiparalelas compórtanse mellor, e as versións paralelas raramente se usan.[14][15]

O motivo estrutural DX é tamén a peza de construción fundamental do método ADN origami, que se utiliza para facer estruturas bi ou tridimensionais máis grandes de forma arbitraria. En lugar de usar baldosas DX individuais, prégase unha febra de armazón longo sinxelo na forma desexada usando varias febras grampa curtas. Cando se ensamblan, a febra armazón é continua a través dos dominios de dobre hélice, mentres que as febras grampa participan nas unións de Holliday como febras de sobrecruzamento.[16]

Demostrouse que hai varios tipos de baldosas que manteñen o ángulo nativo de 60º das unións de Holliday. Unha destas matrices usa baldosas que conteñen catro unións de Holliday nunha disposición en paralelogramo. Esta estrutura tiña a vantaxe de permitir que o ángulo da unión sexa visualizado directamente por medio de microscopia de forza atómica. Ademais, utilizáronse as baldosas de tres unións de Holliday en disposición triangular baseadas no principio da integridade tensional para construír matrices tridimensionais periódicas pensadas para usalas en cristalografía de raios X de biomoléculas.[14][15]

HistoriaEditar

Robin Holliday propuxo esta estrutura como parte do seu modelo de recombinación homóloga en 1964, baseado na súa investigación nos organismos Ustilago maydis e Saccharomyces cerevisiae. O modelo proporciona un mecanismo molecular que explicaba tanto a conversión xénica coma o sobrecruzamento cromosómico. Holliday decatouse de que a vía proposta crearía segmentos de ADN heterodúplex con bases mal apareadas entre diferentes versións dun só xene, e postulou que a célula debe ter un mecanismo para reparar estas discordancias no apareamento de bases, o cal se descubriu máis tarde.[4] Antes do modelo de Holliday, o modelo aceptado implicaba o mecanismo de elección de copia.[17]

No modelo de Holliday orixinal de recombinación homóloga, as roturas dunha soa febra aparecían no mesmo punto dunha febra de cada ADN parental. Os extremos libres de cada febra rota migran despois a través da outra hélice de ADN, na que as febras invasoras se unen aos extremos libres que encontren, o que ten como resultado a formación da unión de Holliday. Como cada febra sobrecruzada se realiña (reanneals) coa súa febra compañeira orixinal, despraza a febra complementaria orixinal cara adiante, facendo que a unión de Holliday migre, creando os segmentos heterodúplex. Dependendo de que febra se utilizou como modelo para reparar a outra, as catro células resultantes dunha meiose poderían acabar con tres copias dun alelo e só unha do outro, en vez das dúas de cada normais, unha propiedade coñecida como conversión xénica.[4]

O modelo orixinal de Holliday asumía que o ADN heterodúplex estaría presente en ambos os cromosomas, mais os datos experimentais obtidos en lévedos refutaron esta idea, o que levou a que o modelo fose posto ao día por Matt Meselson e Charley Radding en 1975, os cales introduciron a idea da migración da rama.[17] Posteriores observacións feitas na década de 1980 levaron a propoñer mecanismos alternativos para a recombinación como o modelo de rotura de dobre febra (de Jack Szostak, Frank Stahl, e outros) e o modelo de aliñamento (annealing) de febra sinxela. Un terceiro modelo, chamado modelo de aliñamento de febra dependente de síntese, non implica unións de Holliday.[4]

A primeira evidencia experimental da estrutura das unións de Holliday procede de estudos de microscopia electrónica feitos ao final da década de 1970, nos que a estrutura de catro brazos era claramente visible en imaxes de ADN de plásmidos e bacteriófagos. Posteriormente na década de 1980, identificáronse os encimas responsables para iniciar a formación das unións de Holliday e de unirse a elas, aínda que en 2004 a identificación das resolvases de unións de Holliday de mamíferos seguía sendo evasiva. En 1983, construíronse as primeiras moléculas de unión de Holliday artificiais a partir de oligonucleótidos sintéticos grazas aos traballos de Nadrian Seeman, o que permitiu un estudo máis directo das súas propiedades físicas. Moitas das análises temperás das estruturas de unión de Holliday inferíronse de estudos de electroforese en xel, FRET, e pegadas de nucleases e de radical hidroxilo. Na década de 1990, os métodos de cristalografía e RMN de ácidos nucleicos xa estaban dispoñibles, e tamén as ferramentas informáticas de modelado molecular.[2][4][18]

Inicialmente, os xenetistas asumiron que a unión adoptaría unha conformación paralela antes que antiparalela porque esta situaría os dúplex homólogos en aliñamento moi próximo.[2] Pero as análises químicas feitas na década de 1980 mostraron que, en realidade, a unión prefería as conformacións antiparalelas, o que foi un descubrimento considerado controvertido, e o propio Robin Holliday dubidaba inicialmente del.[2][4] Non obstante, posteriormente, a estrutura antiparalela foi amplamente aceptada debido a datos de cristalografía de raios X en moléculas in vitro, aínda que en 2004 as implicacións da estrutura in vivo seguían sen esclarecer, especialmente porque a estrutura das unións é alterada a miúdo polas proteínas que se unen a ela.[4]

NotasEditar

  1. O amontoamento pi (pi-stacking) son as interaccións non covalentes atractivas entre aneis aromáticos, e é moi importante entre os aneis das nucleobases do ADN e ARN.
  2. 2,00 2,01 2,02 2,03 2,04 2,05 2,06 2,07 2,08 2,09 2,10 2,11 2,12 2,13 Lilley, David M. J. (2000). "Structures of helical junctions in nucleic acids". Quarterly reviews of biophysics 33 (2): 109–159. PMID 11131562. doi:10.1017/S0033583500003590. 
  3. Bloomfield, Victor A.; Crothers, Donald M.; Tinoco, Jr., Ignacio (2000). Nucleic acids: structures, properties, and functions. Sausalito, California: University Science Books. p. 468. ISBN 0935702490. 
  4. 4,0 4,1 4,2 4,3 4,4 4,5 4,6 4,7 Liu Y, West S (2004). "Happy Hollidays: 40th anniversary of the Holliday junction". Nat Rev Mol Cell Biol 5 (11): 937–44. PMID 15520813. doi:10.1038/nrm1502. 
  5. Sung, P; Klein, H (October 2006). "Mechanism of homologous recombination: mediators and helicases take on regulatory functions". Nature Reviews Molecular Cell Biology 7 (10): 739–750. PMID 16926856. doi:10.1038/nrm2008. 
  6. Hartel, Daniel L.; Ruvolo, Maryellen (2012). Genetics: Analysis of Genetics and Genomes. Burlington: Jones & Bartlett. 
  7. Helleday, T. "Double-Strand Break Repair via Double Holliday Junctions (Szostak Model)". Animation. MIT. 
  8. Rocha, EPC; Cornet, E; Michel, B (August 2005). "Comparative and evolutionary analysis of the bacterial homologous recombination systems". PLoS Genetics 1 (2): e15. PMC 1193525. PMID 16132081. doi:10.1371/journal.pgen.0010015. 
  9. Fleischmann Jr, WR (1996). "43". Medical Microbiology (4th ed.). University of Texas Medical Branch at Galveston. ISBN 0-9631172-1-1. 
  10. West SC (2003). "Molecular views of recombination proteins and their control". Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4 (6): 435–45. PMID 12778123. doi:10.1038/nrm1127. 
  11. Kowalczykowski SC (2000). "Initiation of genetic recombination and recombination-dependent replication". Trends Biochem. Sci. 25 (4): 156–65. PMID 10754547. doi:10.1016/S0968-0004(00)01569-3. 
  12. Boni, MF; de Jong, MD; van Doorn, HR; Holmes, EC; Martin, Darren P. (3 May 2010). Martin, Darren P., ed. "Guidelines for identifying homologous recombination events in influenza a virus". PLoS ONE 5 (5): e10434. PMC 2862710. PMID 20454662. doi:10.1371/journal.pone.0010434. 
  13. Mao, Chengde (December 2004). "The emergence of complexity: lessons from DNA". PLoS Biology 2 (12): 2036–2038. PMC 535573. PMID 15597116. doi:10.1371/journal.pbio.0020431. 
  14. 14,0 14,1 14,2 Seeman, Nadrian C. (June 2004). "Nanotechnology and the double helix". Scientific American 290 (6): 64–75. PMID 15195395. doi:10.1038/scientificamerican0604-64. 
  15. 15,0 15,1 15,2 Nadrian C. Seeman (2010). "Nanomaterials Based on DNA". Annual Review of Biochemistry 79: 65–87. doi:10.1146/annurev-biochem-060308-102244. 
  16. Saccà, Barbara; Niemeyer, Christof M. (2012). "DNA Origami: The Art of Folding DNA" (PDF). Angewandte Chemie Int'd Ed 51 (1): 58–66. doi:10.1002/anie.201105846. Consultado o 25 February 2015. 
  17. 17,0 17,1 Stahl FW (1 October 1994). "The Holliday junction on its thirtieth anniversary" (PDF). Genetics 138 (2): 241–246. PMC 1206142. PMID 7828807. 
  18. Hays FA, Watson J, Ho PS (2003). "Caution! DNA Crossing: Crystal Structures of Holliday Junctions". J Biol Chem 278 (50): 49663–49666. PMID 14563836. doi:10.1074/jbc.R300033200. 

Véxase taménEditar