Pichia pastoris

Pichia pastoris é unha especie de lévedo metilótrofo (pode usar o metanol). É moi utilizado na produción de proteínas por medio de técnicas de ADN recombinante. Utilízase en investigacións bioquímicas e xenéticas en laboratorios académicos e na industria biotecnolóxica. Pichia pastoris é o nome común utilizado para o sistema de expresión, pero o nome da especie foi posteriormente reasisgnado co nome Komagataella phaffii debido aos resultados de análises de secuencias multixénicas.[1]

P. pastoris como sistema de expresiónEditar

P. pastoris utilízase frecuentemente como sistema de expresión para a produción de proteínas. Varias propiedades de P. pastoris fano un organismo axeitado para esta tarefa: ten unha alta taxa de crecemento e pode crecer en medios simples e baratos. Pode crecer tanto en matraces coma nun fermentador, o que o fai adecuado para a produción a pequena ou a longa escala.

P. pastoris ten dous xenes de alcohol oxidase, chamados Aox1 e Aox2, que teñen un forte promotor inducible.[2] Estes dous xenes permiten que a especie poida usar o metanol como fonte de carbono e enerxía. Os promotores AOX son inducidos polo metanol e reprimidos por, por exemplo, a glicosa. Normalmente, o xene para a proteína desexada introdúcese na célula baixo o control do promotor de Aox1, o que significa que a produción de proteínas pode ser inducida pola adición de metanol. Nun vector de expresión moi usado, a proteína desexada prodúcese como produto de fusión co sinal de secreción do factor de apareamento α de Saccharomyces cerevisiae (lévedo de panadaría). Isto causa que a proteína sexa segregada no medio de crecemento, que facilita grandemente a posterior purificación da proteína. Algúns plásmidos dispoñibles comercialmente teñen estas características incorporadas (como o vector pPICZα).[3]

Produción bioterapéuticaEditar

Pichia pastoris foi utilizado para a produción duns 500 compostos bioterapéuticos como, por exemplo, o interferón gamma. Porén, un inconveniente dese sistema de expresión de proteínas é a sobreglicosilación con estrutura alta en manosa, que é unha causa potencial de inmunoxenicidade.[4][5]

Comparación con outros sistemas de expresiónEditar

Na investigación estándar en bioloxía molecular, a bacteria Escherichia coli é o organismo máis frecuentemente usado para a produción de ADN recombinante e proteínas, debido á alta taxa de crecemento de E. coli, unha boa taxa de produción de proteínas, e as condicións de crecemento pouco esixentes. A produción de proteínas en E. coli é xeralmente máis rápida que en P. pastoris por varias razóns: as células de E. coli competentes poden almacenarse conxeladas e desconxeladas inmediatamente antes do uso, mentres que as células de P. pastoris teñen que producirse inmediatamente antes do seu uso. Os rendementos da expresión en Pichia varía entre diferentes clons, e xeralmente debe cribarse un gran número de clons para a produción de proteínas antes de que se encontre un bo produtor. O tempo de indución óptimo de P. pastoris é usualmente da orde de días, mentres que E. coli adoita chegar ao seu rendemento óptimo en cuestión de horas despois da indución. A maior vantaxe de P. pastoris sobre E. coli é que este lévedo pode formar enlaces disulfuro e glicosilacións nas proteínas que produce.[6] Isto significa que en caso de que os enlaces disulfuro sexan necesarios, E. coli podería orixinar unha proteína mal pregada, xeralmente insoluble e inactiva.[7]

A especie ben estudada Saccharomyces cerevisiae é tamén utilizada como sistema de expresión con vantaxes similares sobre E. coli e Pichia. Porén, Pichia ten dúas vantaxes principais sobre S. cerevisiae no laboratorio e instalacións industriais, que son:

En primeiro lugar, Pichia é un metilótrofo, o que significa que pode crecer simplemente con alcohol metanol como única fonte de enerxía. Pode cultivarse doadamente en suspensión de células en solucións razoablemente fortes de metanol que matarían outros microorganismos, un sistema que é barato de establecer e manter.

En segundo lugar, Pichia pode crecer en densidades celulares moi altas, e baixo condicións ideais pode multiplicarse ata o punto en que a suspensión celular é practicamente unha pasta. Como o rendemento de proteínas da expresión nun microbio é aproximadamente igual a multiplicar o produto da proteína producida por célula polo número de células; isto fai que P. pastoris teña un grande uso cando se trata de producir grandes cantidades de proteínas sen usar un equipo caro.[6]

Comparados con outros sistemas de expresión como as células S2 de Drosophila melanogaster ou as células de ovario do hámster chinés, P. pastoris xeralmene dá rendementos moito mellores. As liñas celulares de organismos multicellares xeralmente necesitan un medio rico complexo, que conteña aminoácidos, vitaminas e factores de crecemento. Estes medios incrementan significativamente o custo de producir proteínas recombinantes. Adicionalmente, como P. pastoris pode crecer en medios que conteñan só unha fonte de carbono e unha fonte de nitróxeno, é axeitado para aplicacións etiquetadas isotopicamente en, por exemplo, a resonancia magnética nuclear de proteínas.[6] Porén, algunhas proteínas necesitan chaperoninas para un adecuado pregamento. Así, P. pastoris non pode producir varias proteínas, xa que o hóspede carece das chaperonas adecuadas. En 2006, un grupo de investigadores conseguiron crear unha cepa que produce eritropoetina na súa forma glicosilada normal.[8] Isto conseguiuse intercambiando os encimas responsables da glicosilación de tipo fúnxico, cos homólogos de mamífero. Así, o padrón de glicosilación alterado permitiu que a proteína sexa completamente funcional.

P. pastoris como organismo modeloEditar

Outra vantaxe de P. pastoris é a súa semellanza co lévedo Saccharomyces cerevisiae. Como organismo modelo en bioloxía, que foi utilizado para múltiples propósitos ao longo da historia, S. cerevisiae está moi ben estudado. Estas dúas especies de lévedos teñen condicións de crecemento e tolerancias similares, polo que o cultivo de P. pastoris pode adoptarse facilmente nos laboratorios, sen ter que utilizar un equipo especial.

O xenoma de P. pastoris GS115 foi secuenciado polo Instituto de Flandres de Biotecnoloxía e a Universidade de Gante e publicado en Nature Biotechnology.[9] A secuencia xenómica e anotación de xenes pode consultarse a través do sistema ORCAE.

NotasEditar

  1. Kurtzman, Cletus Paul (November 2009). "Biotechnological strains of Komagataella (Pichia) pastoris are Komagataella phaffii as determined from multigene sequence analysis". Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 36 (11): 1435–1438. ISSN 1476-5535. PMID 19760441. doi:10.1007/s10295-009-0638-4. 
  2. Daly R, Hearn MT (2005). "Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production". J. Mol. Recognit. 18 (2): 119–38. PMID 15565717. doi:10.1002/jmr.687. 
  3. "Description of pPICZα vector by its vendor Invitrogen". 
  4. Razaghi A, Owens L, Heimann K (2016). "Is Pichia pastoris a realistic platform for industrial production of recombinant human interferon gamma?.". Biologicals 45: 52–60. PMID 27810255. doi:10.1016/j.biologicals.2016.09.015. 
  5. Ali Razaghi; Roger Huerlimann; Leigh Owens; Kirsten Heimann (2015). "Increased expression and secretion of recombinant hIFNγ through amino acid starvation-induced selective pressure on the adjacent HIS4 gene in Pichia pastoris". European Pharmaceutical Journal 62 (2): 43–50. doi:10.1515/afpuc-2015-0031. 
  6. 6,0 6,1 6,2 Cregg JM, Tolstorukov I, Kusari A, Sunga J, Madden K, Chappell T (2009). Expression in the yeast Pichia pastoris. Meth. Enzymol. Methods in Enzymology 463. pp. 169–89. ISBN 978-0-12-374536-1. PMID 19892173. doi:10.1016/S0076-6879(09)63013-5. 
  7. Brondyk WH (2009). Selecting an appropriate method for expressing a recombinant protein. Meth. Enzymol. Methods in Enzymology 463. pp. 131–47. ISBN 978-0-12-374536-1. PMID 19892171. doi:10.1016/S0076-6879(09)63011-1. 
  8. Hamilton SR, Davidson RC, Sethuraman N, et al. (September 2006). "Humanization of yeast to produce complex terminally sialylated glycoproteins". Science 313 (5792): 1441–3. PMID 16960007. doi:10.1126/science.1130256. 
  9. De Schutter K.; Lin Y.-C.; Tiels P; et al. (2009). "Genome sequence of the recombinant protein production host Pichia pastoris". Nature Biotechnology 27 (6): 561–566. PMID 19465926. doi:10.1038/nbt.1544.