Peroxidase de ravo picante
A peroxidase de ravo picante (HRP polas súas siglas en inglés de horseradish peroxidase) é un encima peroxidase que se encontra nas raíces do ravo picante (Armoracia rusticana). Utilízase amplamente en aplicacións en bioquímica principalmente pola súa capacidade de amplificar un sinal feble e incrementar a detectabilidade dunha diana molecular. É un metaloencima con moitas isoformas, da cal o tipo máis estudado é o C.
| Peroxidase de ravo picante | |
|---|---|
| |
| Peroxidase de ravo picante C1[1] | |
| Identificadores | |
| Organismo | |
| Símbolo | Peroxidase C1A |
| Alt. symbols | PRXC1A |
| PDB | 1GWU Máis estruturas |
| UniProt | P00433 |
| Outros datos | |
| Número EC | 1.11.1.7 |
Estrutura editar
A estrutura do encima resolveuse por primeira vez por cristalografía de raios X en 1997[2] e desde entón foi resolta varias veces máis con diversos substratos.[3] É unha proteína en hélice alfa que leva unido un grupo hemo como cofactor redox.
Substratos editar
O encima HRP só ou conxugado é de pouco valor en bioquímica; a súa presenza debe facerse visible utilizando un substrato que, cando se oxida por acción da HRP usando peróxido de hidróxeno como axente oxidante, produce un característico cambio que é detectable por métodos espectrofotométricos.[4][5]
Describíronse numerosos substratos da peroxidase de ravo picante, que foron comercializados para aproveitar as características desexables da HRP. Estes substratos poden pertencer a varias categorías. O HRP cataliza a conversión de substratos cromoxénicos (por exemplo, o TMB, DAB, ABTS) en produtos coloreados, e produce luz cando actúa sobre substratos quimioluminescentes (por exemplo a quimioluminescencia potenciada polo luminol).
Aplicacións editar
A peroxidase de ravo picante é unha glicoproteína de 44.173,9 daltons que ten 6 residuos de lisina que poden ser conxugados a unha molécula etiquetada. Cando se incuba cun substrato axeitado produce un derivado coloreado fluorimétrico ou derivado luminescente da molécula etiquetada, o que permite que sexa detectado e cuantificado. A HRP úsase a miúdo en conxugados (moléculas que foron enlazadas xeneticamente ou quimicamente) para determinar a presenza dunha diana molecular. Por exemplo, pode utilizarse un anticorpo conxugado á HRP para detectar unha pequena cantidade de proteínas específicas na técnica do western blot. Aquí, o anticorpo proporciona a especificidade para localizar a proteína de interese, e o encima HRP, en presenza dun substrato, produce un sinal detectable.[6] A peroxidase de ravo picante úsase tamén comunmente en técnicas como ELISA e a inmunohistoquímica debido á súa natureza monomérica e á facilidade coa cal produce produtos coloreados.
A peroxidase de ravo picante é ideal en moitos aspectos para estas aplicacións porque é menor, máis estable e máis barata que outras alternativas correntes como a fosfatase alcalina. Tamén ten unha alta velocidade de recambio (turnover) que permite a xeración de sinais fortes nun espazo de tempo relativamene curto.[7]
Ademais, "en anos recentes a técnica de marcar neuronas co encima peroxidase de ravo picante converteuse nunha importante ferramenta. Na súa breve historia, este método probablemente foi utilizado por máis neurobiólogos que os que utilizaron a tinguidura de Golgi desde o seu descubrimento en 1870."[8]
Potenciación da luminescencia editar
- Artigo principal: Quimioluminescencia.
A peroxidase de ravo picante cataliza a oxidación do luminol a 3-aminoftalato por medio de varios intermediarios. A reacción é acompañada pola emisión de luz de baixa intensidade a 428 nm. Porén, en presenza de certos compostos químicos, a luz emitida é potenciada ata ser 1000 veces maior, o que fai que a luz sexa doada de detectar, incrementando a sensibilidae da reacción. A potenciación da emisión de luz denomínase quimioluninescencia potenciada ou aumentada (ECL, do inglés enhanced chemiluminescence). Poden utilizarse varios potenciadores, pero os máis efectivos son fenois modificados, especialmente o p-iodofenol. A intensidade da luz é unha medida do número de moléculas de encima que están reaccionando e así da cantidade de híbrido. A quimioluminescencia potenciada establécese de forma simple e é sensible, e pode detectar uns 0,5 pg de ácido nucleico en Southern blots e northern blots. A detección por medio de substratos quimioluminescentes ten varias vantaxes sobre o uso de substratos cromoxénicos. A sensibilidade é de 10 a 100 veces maior, e a cuantificación da cantidade de luz emitida é posible nun amplo rango dinámico, mentres que cos precipita<dos coloreados é moito máis limitada, de aproximadamente unha orde de magnitude inferior. Os filtros de bandas (stripping filters) son moito máis fáciles cando se usan os substratos quimioluminescentes.
Notas editar
- ↑ PDB 1w4y; Carlsson GH, Nicholls P, Svistunenko D, Berglund GI, Hajdu J (Jan 2005). "Complexes of horseradish peroxidase with formate, acetate, and carbon monoxide". Biochemistry 44 (2): 635–42. PMID 15641789. doi:10.1021/bi0483211.
- ↑ PDB 1GWU; Gajhede M, Schuller DJ, Henriksen A, Smith AT, Poulos TL (Dec 1997). "Crystal structure of horseradish peroxidase C at 2.15 A resolution". Nature Structural Biology 4 (12): 1032–8. PMID 9406554. doi:10.1038/nsb1297-1032.
- ↑ "Peroxidase C1A Related PDB sequences". UniPDB. European Bioinformatics Institute. Arquivado dende o orixinal o 13 de setembro de 2019. Consultado o 05 de decembro de 2015.
- ↑ Veitch NC (Feb 2004). "Horseradish peroxidase: a modern view of a classic enzyme". Phytochemistry 65 (3): 249–59. PMID 14751298. doi:10.1016/j.phytochem.2003.10.022.
- ↑ Akkara JA, Senecal KJ, Kaplan DL (October 1991). "Synthesis and characterization of polymers produced by horseradish peroxidase in dioxane". Journal of Polymer Science 29 (11): 1561–74. doi:10.1002/pola.1991.080291105.
- ↑ Chau YP, Lu KS (1995). "Investigation of the blood-ganglion barrier properties in rat sympathetic ganglia by using lanthanum ion and horseradish peroxidase as tracers". Acta Anatomica 153 (2): 135–44. PMID 8560966. doi:10.1159/000313647.
- ↑ Beyzavi K, Hampton S, Kwasowski P, Fickling S, Marks V, Clift R (Mar 1987). "Comparison of horseradish peroxidase and alkaline phosphatase-labelled antibodies in enzyme immunoassays". Annals of Clinical Biochemistry. 24 ( Pt 2): 145–52. PMID 3035992.
- ↑ Lichtman JW, Purves D (1985). "Cell marking with horseradish peroxidase". Principles of neural development. Sunderland, Mass: Sinauer Associates. p. 114. ISBN 978-0-87893-744-8.
Véxase tamén editar
Ligazóns externas editar
- Horseradish peroxidase Medical Subject Headings (MeSH) na Biblioteca Nacional de Medicina dos EUA.