Abrir o menú principal

En clonación molecular, un vector é unha molécula de ADN usada como vehículo para transportar artificialmente material xenético alleo a outra célula, onde pode ser replicado ou expresado (por exemplo, un plásmido, cósmido, fago lambda). Un vector que conteña un ADN alleo denomínase ADN recombinante. Os catro tipos principais de vectores son plásmidos, vectores virais, cósmidos e cromosomas artificiais. Destes os vectores que máis se usan son os plásmidos.[1] Unhas características comúns a todos os vectores usados en enxeñaría son ter unha orixe de replicación, un sitio de clonación múltiple e un marcador seleccionable.

O vector é unha secuencia de ADN que consiste nun inserto (transxene) e unha secuencia máis grande que serve como "esqueleto" do vector. O propósito dun vector que transfire información xenética a outra célula é tipicamente illar, multiplicar ou expresar o inserto na célula diana. Todos os vectores poden usarse para a clonación e, por tanto, son vectores de clonación, pero hai tamén vectores deseñados especialmente para a clonación, mentres que outros poden ser deseñados especificamente para outros propósitos, como a transcrición e a expresión proteica. Os vectores deseñados especificamente para a expresión do transxene na célula diana denomínanse vectores de expresión e xeralmente teñen unha secuencia promotora que dirixe a expresión do transxene. Os vectores máis simples, chamados vectores de transcrición só poden ser transcritos pero non traducidos: poden ser replicados nunha célula diana mais non expresados, a diferenza dos vectores de expresión. Os vectores de transcrición son usados para amplificar os seus insertos.

A manipulación do ADN realízase normalmente con vectores de E. coli, que conteñen os elementos necesarios para o seu mantemento en E. coli. Porén, os vectores poden tamén ter elementos que lles permiten ser mantidos noutros organismos como as células de lévedos, plantas ou mamíferos, e estes vectores denomínanse vectores lanzadeira. Tales vectores teñen elementos bacterianos ou virais, que poden ser transferidos ao organismo hóspede non bacteriano; porén, tamén se desenvolveron outros vectores denominados intraxénicos para evitar a transferencia de calquera material xenético dunha especie allea.[2]

A inserción dun vector nunha célula diana é denominada xeralmente transformación nas células bacterianas[3] e transfección nas células eucariotas,[4] aínda que a inserción dun vector viral adoita denominarse transdución.[5]

CaracterísticasEditar

PlásmidosEditar

Artigo principal: Vector plásmido.

Os plásmidos son secuencias de ADN de dobre cadea extracromosómicos e xeralmente circulares que poden replicarse usando a maquinaria de replicación da célula hóspede.[6] Os vectores plásmidos como mínimo constan dunha orixe de replicación que permite a replicación semiindependente do plásmido no hóspede. A presenza de plásmidos está moi estendida entre as bacterias, por exemplo en Escherichia coli, pero poden tamén encontrarse nalgúns eucariotas, por exemplo en lévedos como Saccharomyces cerevisiae.[7] Os plásmidos bacterianos poden ser conxugativos/transmisibles e non conxugativos:

  • Conxugativos. Son mediadores da transferencia de ADN por conxugación e, por tanto, espállanse rapidamente entre as células bacterianas dunha poboación; por exemplo, os plásmidos F, moitos plásmidos R e algúns plásmidos Col.
  • Non conxugativos. Non media a transferencia de ADN por conxugación, por exemplo, moitos plásmidos R e Col.
 
O plásmido pBR322 foi un dos primeiros plásmidos en ser amplamente utilizado como vector de clonación.

Os plásmidos con características construídas especialmente son usados comunmente no laboratorio para realizar clonacións. Estes plásmidos son xeralmente non conxugativos, pero poden ter moitas máis características, especialmente un sitio de clonación múltiple, no que os sitios de clivaxe de moitos encimas de restrición permiten a inserción dun inserto transxene. As bacterias que conteñen os plásmidos poden xerar millóns de copias do vector dentro da bacteria en cuestión de horas, e os vectores amplificados poden ser extraídos a partir de bacterias para unha posterior manipulación. Os plásmidos poden usarse especificamente como vectores de transcrición e tales plásmidos poden carecer de secuencias esenciais para a expresión de proteínas. Os plásmidos utilizados para a expresión de proteínas, chamados vectores de expresión, inclúen elementos para a tradución de proteínas, como un sitio de unión ao ribosoma e codóns de iniciación e de parada.

Vectores viraisEditar

Artigo principal: Vector viral.

Os vectores virais son xeralmente virus modificados por enxeñaría xenética que transportan ADN ou ARN viral modificado que foi convertido en non infeccioso, pero que aínda conteñen promotores virais e tamén o transxene, permitindo así a tradución do transxene por medio do promotor viral. Porén, como os vectores virais frecuentemente carecen de secuencias infecciosas, necesitan virus axudantes ou liñas de empaquetamento para a transfección a longa escala. Os vectores virais deséñanse a miúdo pola incorporación permanente do inserto no xenoma hóspede, e así deixan un claro marcador xenético no xenoma hóspede despois de incorporaren o transxene. Por exemplo, os retrovirus deixan un característico padrón de integración retroviral despois da inserción que é detectable e indica que o vector viral se incorporou no xenoma hóspede.

Cromosomas artificiaisEditar

Artigo principal: Cromosoma artificial.

Os cromosomas artificiais poden ser cromosomas artificiais de lévedos (YAC), cromosomas artificiais bacterianos (BAC) ou cromosomas artificiais humanos (HAC). Un cromosoma artificial pode transportar un fragmento de ADN moito maior que outros vectores.[8] Os cromosomas artificiais de lévedos e bacterianos poden portar un fragmento de ADN de ata 300 000 nucleótidos de longo. Os cromosomas artificiais deben ter necesariamente unha orixe de replicación, un centrómero, e secuencias finais teloméricas.[9]

TranscriciónEditar

A transcrición dun xene clonado é un compoñente necesario dun vector cando é necesaria a expresión do xene: un xene pode ser amplificado por transcrición para xerar múltiples copias de ARNm, o molde a partir do cal pode producirse unha proteína por tradución.[10] Un número maior de ARNm expresará unha maior cantidade de proteína, e a cantidade de copias do ARNm xeradas depende do promotor usado no vector.[11] A expresión pode ser constitutiva, o que significa que a proteína se produce constantemente ou pode ser indicible cando a proteína se expresa só en certas condicións, por exemplo cando se engade un composto químico indutor. Estes dous tipos de expresión dependen dos tipos de promotor e operador usados.

Os promotores virais utilízanse a miúdo para a expresión constitutiva en plásmidos e en vectores virais porque normalmentre forzan a transcrición constante en moitas liñas celulares e tipos fiables.[12] A expresión inducible depende dos promotores que responden ás condicións de indución: por exemplo, o promotor do virus de tumor mamario murino soamente inicia a transcrición despois da aplicación de dexametasona e o promotor de shock térmico de Drosophilia só a inicia despois de ser sometido a altas temperaturas.

Algúns vectores son designados só para a transcrición, por exemplo para a produción in vitro de ARNm. Estes vectores denomínanse vectores de transcrición. Poden carecer das secuencias necesarias para a poliadenilación e a terminación, e, por tano, non se usan para a produción de proteínas.

ExpresiónEditar

Artigo principal: Vector de expresión.

Os vectores de expresión producen proteínas por medio da transcrición do inserto do vector seguido pola tradución do ARNm producido, e, por tanto, requiren diferentes elementos que os vectores de só transcrición máis simples. A expresión en diferentes organismos hóspedes requerirán elementos diferentes, aínda que comparten requirimentos similares, por exemplo un promoter para a iniciación da transcrición, un sitio de unión ao ribosoma para a iniciación da tradución e sinais de terminación.

Vector de expresión de procariotasEditar

Consta de:

Vector de expresión de eucariotasEditar

Requiren secuencias que codifiquen para:

  • Cola de poliadenilación. Crea unha cola de poliadenilación no extremo dun pre-ARNm transcrito que proxete o ARNm da acción de exonucleases e asegura a terminición transcricional e traducional: estabiliza a produción de ARNm.
  • UTR de lonxitude mínima. Os UTR conteñen características específicas que poden impedir a transcrición ou tradución e así codifícanse os UTR máis curtos ou ningún en absoluto en vectores de expresión óptimos.
  • Secuencia Kozak. Os vectores deberían codificar unha secuencia Kozak no ARNm, que ensambla o ribosoma para a tradución do ARNm.

CaracterísticasEditar

Os vectores construídos artificialmente modernos conteñen compoñentes esenciais que se encontran en todos os vectores, e poden conter outras características adicionais que se encontran só nalgúns vectroes:

  • Orixe de replicación. Necesario para a replicación e mantemento do vector na célula hóspede.
  • Promotor. Os promotores utilízanse para impulsar a transcrición do transxene do vector así como outros xenes no vector como os xenes de resistencia a antibióticos. Algúns vectores de clonación non necesitan ter un promotor para o inserto clonado, pero é un compoñente esencial de vectores de expresión para que o produto clonado se poida expresar.
  • Sitio de clonación. Pode ser un sitio de clonación múltiple ou outra característica que permita a inserción do ADN alleo no vector por medio da ligación.
  • Marcadores xenéticos. Os marcadores xenéticos para os vectores virais permiten confirmar que o vector se integrou co ADN xenómico do hóspede.
  • Resistencia a antibióticos. Os vectores con marcos de lectura abertos para a resistencia a antibióticos permiten a supervivencia de células que captaron o vector nun medio de crecemento que contiña antibióticos por selección de antibiótico.
  • Epítopo. Algúns vectores poden conter unha secuencia para un epítopo específico, que pode ser incorporada na proteína expresada. Permite a identificación por antibióticos de células que expresan a proteína diana.
  • Xenes reporteiros. Algúns vectores poden conter un xene reporteiro que permite a identificación do plásmido que contén a secuencia de ADN inserida. Un exemplo é lacZ-α que codifica o fragmento N-terminal da β-galactosidase, un encima que dixire a galactosa. Dentro do lacZ-α está localizado un sitio de clonación múltiple, e un inserto é ligado con éxito no vector distorsiona a secuencia do xene, o que ten como resultado unha β-galactosidase inactiva. As células que conteñen vectores cun inserto poden ser identificadas usando unha selección azul/branca facendo crecer as células en medios que conteñan un análogo da galactosa (X-gal). As células que expresan β-galactosidase (que, por tanto, non conteñen o inserto) aparecen como colonias azuis. As colonias brancas serían seleccionadas como colonias que poden conter un inserto. Outros reporteiros usados comunmente inclúen a proteína fluorescente verde e a luciferase.
  • Secuencia diana. Os vectores de expresión poden incluír a codificación dunha secuencia diana na proteína finalizada que dirixe a proteína expresada a un orgánulo específico da célula ou a unha localización específica como o espazo periplásmico das bacterias.
  • Etiquetas de purificación de proteínas. Algúns vectores de expresión inclúen proteínas ou secuencias de péptidos que permiten unha purificación máis doada das proteínas expresadas. Exemplos son a etiqueta de polihistidina, a glutatión-S-transferase e a proteína de unión á maltosa. Algunhas destas etiquetas poden tamén permitir o incremento da solubilidadce da proteína diana. A proteína diana fusiónase á etiqueta proteica, pero unha protease cliva o sitio situado na rexión linker polipeptídica entre a proteína e a etiqueta, o que permite que a etiqueta sexa despois eliminada.

NotasEditar

  1. Lodish H, Berk A, Zipursky SL, Matsudaira P, Baltimore D, Darnell J (2000). "DNA Cloning with Plasmid Vectors". Molecular Cell Biology (4th ed.). New York: W. H. Freeman. 
  2. Acquaah G (16 August 2012). Principles of Plant Genetics and Breeding. John Wiley & Sons Inc. ISBN 978-1-118-31369-5. 
  3. Johnston C, Martin B, Fichant G, Polard P, Claverys JP (March 2014). "Bacterial transformation: distribution, shared mechanisms and divergent control". Nature Reviews. Microbiology 12 (3): 181–96. PMID 24509783. doi:10.1038/nrmicro3199. 
  4. "MeSH Browser". meshb.nlm.nih.gov (en inglés). Consultado o 2018-04-16. 
  5. Hartl DL, Jones EW (1998). Genetics: principles and analysis (4th ed.). Sudbury, Mass.: Jones and Bartlett Publishers. ISBN 978-0-7637-0489-6. OCLC 45730915. 
  6. del Solar, Gloria; Giraldo, Rafael; Ruiz-Echevarría, María Jesús; Espinosa, Manuel; Díaz-Orejas, Ramón (June 1998). "Replication and Control of Circular Bacterial Plasmids". Microbiology and Molecular Biology Reviews 62 (2): 434–464. ISSN 1092-2172. PMC 98921. PMID 9618448. 
  7. Brown TA (2010). "Chapter 2 - Vectors for Gene Cloning: Plasmids and Bacteriophages". Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction (6th ed.). Wiley-Blackwell. ISBN 978-1-4051-8173-0. 
  8. Julin, Douglas (2014). Molecular Life Sciences (en inglés). Springer, New York, NY. pp. 1–3. doi:10.1007/978-1-4614-6436-5_91-3. 
  9. Murray, Andrew; Szostak, Jack (November 1987). "Artificial Chromosomes". Scientific American 257 (5): 62–68. 
  10. Solomon EP, Berg LR, Martin DW (2005). Biology (8th ed.). Belmont, CA: Brooks/Cole Thomson Learning. ISBN 978-0-495-31714-2. OCLC 123008833. 
  11. Damdindorj L, Karnan S, Ota A, Hossain E, Konishi Y, Hosokawa Y, Konishi H (2014-08-29). "A comparative analysis of constitutive promoters located in adeno-associated viral vectors". PLOS One 9 (8): e106472. PMC 4149579. PMID 25170953. doi:10.1371/journal.pone.0106472. 
  12. Lewin A, Mayer M, Chusainow J, Jacob D, Appel B (June 2005). "Viral promoters can initiate expression of toxin genes introduced into Escherichia coli". BMC Biotechnology 5: 19. PMC 1181807. PMID 15967027. doi:10.1186/1472-6750-5-19. 

Véxase taménEditar