Proteína de unión á maltosa

A proteína de unión á maltosa (ou que se liga á maltosa), abreviada como MBP (do inglés maltose-binding protein) é unha proteína que forma parte do sistema maltosa/maltodextrina da bacteria Escherichia coli, que é resonsable da captación e catabolismo eficiente das maltodextrinas. Trátase dun complexo sistema de transporte e regulación que implica moitas proteínas e complexos proteicos. A MBP ten unha masa molecular aproximada de 42,5 kDa.

Estrutura e pregamentoEditar

A MBP está codificada polo xene malE de Escherichia coli. O xene malE codifica un polipéptido precursor de 396 residuos de aminoácidos), que orixina a MBP madura de 370 residuos por clivaxe da extensión NH2-terminal (26 residuos). As formas precursora e madura da MBP non conteñen ningún residuo de cisteína].[1]

A MBP é unha proteína monomérica. As estruturas cristalinas mostran que a MBP está dividida en dous dominios globulares que están conectados por tres segmentos polipeptídicos curtos. Os dous dominios están separados por unha fenda profunda que contén o sitio de unión da maltosa/maltodextrinas. A comparación das estruturas das formas unidas a ligando e non unidas da MBP mostran que a unión da maltosa induce un gran cambio conformacional que pecha a fenda por medio dun movemento dos dous dominios arredor da bisagra polipeptidica de unión.[2][3]

Tanto a forma precursora coma a madura da MBP son funcionais para a unión da maltosa.[4] A extensión NH2-terminal diminúe a taxa de pregamento da forma precursora da MBP en relación coa súa forma madura a aproximadamente a 5ª parte, pero non ten efecto sobre a taxa de despregamento.[5][6] O despregamento en equilibrio da MBP pode ser modelado por un mecanismo con dous estados cunha estabilidade ∆G(H2O) igual a 9,45 kcal mol−1 a 25 °C, pH 7,6.[7]

Localización e exportaciónEditar

A MBP é exportada ao espazo periplásmico de E. coli.[8] A extensión NH2-terminal da MBP, tamén chamada péptido sinal, ten dúas funcións: (1) fai máis lento o pregamento do polipéptido acabado de sintetizar, e (2) dirixe este polipéptido á membrana e ao translocón SecYEG. Unha vez pregado, o precursor xa non pode entrar na vía de translocación.[9] A introdución dun residuo de aminoácido cargado ou un residuo de prolina dentro do núcleo hidrófobo do péptido sinal é dabondo para bloquear a exportación.[10] A exportación defectuosa que presentan as MBP mutantes é consistente coa conformación alfa-helicoidal e as interaccións hidrofóbicas do péptido sinal nas súas interaccións coa proteína motora translocón SecA.[11][12][13]

Control da expresiónEditar

O xene malE, que codifica a MBP, pertence ao regulón Mal de E. coli, que consta de dez xenes cuxos produtos están dedicados á captación eficiente e utilización da maltosa e maltodextrinas. Todos os xenes implicados no transporte da maltosa/maltodextrina, incluíndo o malE, están agrupados na rexión malB de E. coli e organizados en dous operóns diverxentes: malE-malF-malG e malK-lamB.[14] Os sitios de comezo da transcrición nos promotores de malEp e malKp están separados por unha distancia de 271 pares de bases.[15]

Os promotores de malEp e malKp son activados sinerxicamente pola proteína MalT, o activador do regulón Mal e pola proteína receptora do AMPc CRP. Esta activación é un proceso acoplado que implica, indo desde o malEp cara ao malKp: dous sitios de unión de MalT; tres sitios de unión a CRP e dous conxuntos solapantes de tres sitios de unión de MalT, separados por un tramo de tres pares de bases.[15][16][17] A activación da transcrición require a unión de adenosín trifosfato (ATP) e maltotriosa ao MalT e a unión de AMP cíclico ao dímero de CRP.[18] A forma non unida a ligando da MalT é monomérica, mentres que a forma unida a ligando, en presenza de ATP e maltotriosa, é oligomérica.[19]

Uso como vector peptídico e proteicoEditar

A MBP utilízase para incrementar a solubilidade das proteínas recombinantes expresadas en E. coli. Nestes sistemas, a proteína de interese exprésase a miúdo como unha MBP-proteína de fusión, o que prevén a agregación da proteína de interese. O mecanismo polo cal a MBP incremente a solubilidade non se coñece ben. Ademais, a propia MBP pode utilizarse como etiqueta de afinidade para a purificación de proteínas recombinantes. A proteína de fusión únese a columnas de amilosa mentres que todas as demais proteínas flúen ao seu través. A MBP-proteína de fusión pode ser purificada eluíndo a columna con maltosa. Unha vez que a proteína de fusión se obtén en forma purificada, a proteína de interese (X) é a miúdo clivada da MBP cunha protease específica. A proteína X pode despois ser separada da MBP por cromatografía de afinidade.

Un primeiro estudo das relacións entre a estrutura e as funcións da MBP foi realizado por inserción aleatoria dun curto fragmento de ADN, que codifica un sitio de restrición de BamHI, no xene malE. Algunhas das insercións afectaban as funcións da MBP mentres que outras eran permisivas.[20][21] Os sitios permisivos que eran internos á MBP, foron usados para inserir péptidos antixénicos e estimulaban a resposta inmune en ratos.[22] As insercións 3'-OH terminais foron utilizadas para crear proteínas de fusión e desenvolven o uso da MBP como soporte de afinidade para a purificación de proteínas e péptidos alleos por cromatografía de afinidade en amilosa con ligazóns cruzadas e a elución con maltosa en condicións físico-químicas suaves.[23][24] Desenvolvéronse varios vectores plásmidos para facilitar a expresión e purificación desas proteínas de fusión.[25]

Cando a MBP recombinante inclúe un péptido sinal, a proteína de fusión pode ser exportada ao espazo periplásmico, o cal facilita a súa purificación, xa que o fluído periplásmico só contén un número limitado de proteínas e pode ser recuperado por shock osmótico ou por permeabilización da membrana externa con antibióticos, por exemplo a polimixina B sulfato. Esta exportación da proteína de fusión no espazo periplásmico permite a formación de pontes disulfuro na proteína pasaxeira, por exemplo, fragmentos de anticorpo.[26][27] As proteínas alleas que son exportadas ou segregadas nos seus organismos nativos, poden xeralmente ser exportadas ao periplasma de E. coli por fusión coa MBP. Exemplos de proteínas citoplasmáticas que poderían ser exportadas por fusión coa MBP, inclúen a polimerase de Klenow monomérica e a proteína do xene V dimérica do fago M13.[23][28] Cando a MBP recombinante inclúe un péptido sinal defectuoso ou carece del a proteína de fusión permanece dentro do citoplasma bacteriano desde onde pode ser recuperada rompendo as células.

As proteínas de fusión con MBP xeralmente melloran a súa solubilkidade e facilitan o seu propio pregamento para que as proteínas de fusión sexan as máis das veces bifuncionais.[23][29] Ademais, tales fusións poden facilitar a cristalización de proteínas difíciles, por exemplo as proteínas de membranas.[30]

NotasEditar

  1. Duplay, P; Bedouelle, H; Fowler, A; Zabin, I; Saurin, W; Hofnung, M (1984). "Sequences of the malE gene and of its product, the maltose-binding protein of Escherichia coli K12". J Biol Chem 259 (16): 10606–10613. PMID 6088507. 
  2. Spurlino, JC; Lu, GY; Quiocho, FA (1991). "The 2.3-Å resolution structure of the maltose- or maltodextrin-binding protein, a primary receptor of bacterial active transport and chemotaxis". J Biol Chem 266 (8): 5202–5219. PMID 2002054. 
  3. Sharff, AJ; Rodseth, LE; Spurlino, JC; Quiocho, FA (1992). "Crystallographic evidence of a large ligand-induced hinge-twist motion between the two domains of the maltodextrin binding protein involved in active transport and chemotaxis". Biochemistry 31 (44): 10657–10663. PMID 1420181. doi:10.1021/bi00159a003. 
  4. Ferenci, T; Randall, LL (1979). "Precursor maltose-binding protein is active in binding substrate". J Biol Chem 254 (20): 9979–9981. PMID 385604. 
  5. Park, S; Liu, G; Topping, TB; Cover, WH; Randall, LL (1988). "Modulation of folding pathways of exported proteins by the leader sequence". Science 239 (4843): 1033–1035. PMID 3278378. doi:10.1126/science.3278378. 
  6. Beena, K; Udgaonkar, JB; Varadarajan R, R (2004). "Effect of signal peptide on the stability and folding kinetics of maltose binding protein". Biochemistry 43 (12): 3608–3619. PMID 15035631. doi:10.1021/bi0360509. 
  7. Chun, SY; Strobel, S; Bassford, P Jr; Randall, LL (1993). "Folding of maltose-binding protein. Evidence for the identity of the rate-determining step in vivo and in vitro". J Biol Chem 268 (28): 20855–20862. PMID 8407916. 
  8. Kellermann, O; Szmelcman, S (1974). "Active transport of maltose in Escherichia coli K12. Involvement of a "periplasmic" maltose binding protein". Eur J Biochem 47 (1): 139–149. PMID 4215651. doi:10.1111/j.1432-1033.1974.tb03677.x. 
  9. Randall, LL; Hardy, SJ (1986). "Correlation of competence for export with lack of tertiary structure of the mature species: a study in vivo of maltose-binding protein in E. coli". Cell 46 (6): 921–928. PMID 3530497. doi:10.1016/0092-8674(86)90074-7. 
  10. Bedouelle, H; Bassford, PJ Jr; Fowler, AV; Zabin, I; Beckwith, J; Hofnung, M (1980). "Mutations which alter the function of the signal sequence of the maltose binding protein of Escherichia coli". Nature 285 (5760): 78–81. PMID 6990274. doi:10.1038/285078a0. 
  11. Bedouelle, H; Hofnung, M (1981). "Functional implications of secondary structure analysis of wild type and mutant bacterial signal peptides". Prog Clin Biol Res 63: 399–403. PMID 7312870. 
  12. Chou, YT; Gierasch, LM (2005). "The conformation of a signal peptide bound by Escherichia coli preprotein translocase SecA". J Biol Chem 280 (38): 32753–32760. PMID 16046390. doi:10.1074/jbc.M507532200. 
  13. Gelis, I; Bonvin, AM; Keramisanou, D; Koukaki, M; Gouridis, G; Karamanou, S; Economou, A; Kalodimos, CG (2007). "Structural basis for signal-sequence recognition by the translocase motor SecA as determined by NMR". Cell 131 (4): 756–769. PMC 2170882. PMID 18022369. doi:10.1016/j.cell.2007.09.039. 
  14. Boos, W; Shuman, H (1998). "Maltose/maltodextrin system of Escherichia coli: transport, metabolism, and regulation". Microbiol Mol Biol Rev 62 (1): 204–229. PMC 98911. PMID 9529892. 
  15. 15,0 15,1 Bedouelle, H; Schmeissner, U; Hofnung, M; Rosenberg, M (1982). "Promoters of the malEFG and malK-lamB operons in Escherichia coli K12". J Mol Biol 161 (4): 519–531. PMID 6185687. doi:10.1016/0022-2836(82)90405-3. 
  16. Bedouelle, Hugues (1983). "Mutations in the promoter regions of the malEFG and malK-lamB operons of Escherichia coli K12". J Mol Biol 170 (4): 861–882. PMID 6417341. doi:10.1016/s0022-2836(83)80192-2. 
  17. Richet, E (2000). "Synergistic transcription activation: a dual role for CRP in the activation of an Escherichia coli promoter depending on MalT and CRP". EMBO J 19 (19): 5222–5232. PMC 302108. PMID 11013224. doi:10.1093/emboj/19.19.5222. 
  18. Richet, E; Raibaud, O (1989). "MalT, the regulatory protein of the Escherichia coli maltose system, is an ATP-dependent transcriptional activator". EMBO J 8 (3): 981–987. PMC 400900. PMID 2524384. 
  19. Schreiber, V; Richet, E (1999). "Self-association of the Escherichia coli transcription activator MalT in the presence of maltotriose and ATP". J Biol Chem 274 (47): 33220–33226. PMID 10559195. doi:10.1074/jbc.274.47.33220. 
  20. Duplay, P; Bedouelle, H; Szmelcman, S; Hofnung, M (1985). "Linker mutagenesis in the gene encoding the periplasmic maltose-binding protein of E. coli". Biochimie 67 (7–8): 849–851. PMID 3002495. doi:10.1016/s0300-9084(85)80178-4. 
  21. Duplay, P; Szmelcman, S; Bedouelle, H; Hofnung, M (1987). "Silent and functional changes in the periplasmic maltose-binding protein of Escherichia coli K12. I. Transport of maltose". J Mol Biol 194 (4): 663–673. PMID 2821264. doi:10.1016/0022-2836(87)90243-9. 
  22. Coëffier, E; Clément, JM; Cussac, V; Khodaei-Boorane, N; Jehanno, M; Rojas, M; Dridi, A; Latour, M; El Habib, R; Barré-Sinoussi, F; Hofnung, M; Leclerc, C (2000). "Antigenicity and immunogenicity of the HIV-1 gp41 epitope ELDKWA inserted into permissive sites of the MalE protein". Vaccine 19 (7–8): 684–693. PMID 11115689. doi:10.1016/s0264-410x(00)00267-x. 
  23. 23,0 23,1 23,2 Bedouelle, H; Duplay, P (1988). "Production in Escherichia coli and one-step purification of bifunctional hybrid proteins which bind maltose. Export of the Klenow polymerase into the periplasmic space". Eur J Biochem 171 (3): 541–549. PMID 3278900. doi:10.1111/j.1432-1033.1988.tb13823.x. 
  24. Rondard, P; Brégégère, F; Lecroisey, A; Delepierre, M; Bedouelle, H (1997). "Conformational and functional properties of an undecapeptide epitope fused with the C-terminal end of the maltose binding protein". Biochemistry 36 (29): 8954–8961. PMID 9220983. doi:10.1021/bi962508d. 
  25. di Guan, C; Li, P; Riggs, PD; Inouye, H (1988). "Vectors that facilitate the expression and purification of foreign peptides in Escherichia coli by fusion to maltose-binding protein". Gene 67 (1): 21–30. PMID 2843437. doi:10.1016/0378-1119(88)90004-2. 
  26. Brégégère, F; Schwartz, J; Bedouelle, H (1994). "Bifunctional hybrids between the variable domains of an immunoglobulin and the maltose-binding protein of Escherichia coli: production, purification and antigen binding". Protein Eng 7 (2): 271–280. PMID 8170930. 
  27. Malik, A (2016). "Protein fusion tags for efficient expression and purification of recombinant proteins in the periplasmic space of E. coli". 3 Biotech 6 (44). doi:10.1007/s13205-016-0397-7. 
  28. Blondel, A; Bedouelle, H (1990). "Export and purification of a cytoplasmic dimeric protein by fusion to the maltose-binding protein of Escherichia coli". Eur J Biochem 193 (2): 325–330. PMID 2226455. doi:10.1111/j.1432-1033.1990.tb19341.x. 
  29. Kapust, RB; Waugh, DS (1999). "Escherichia coli maltose-binding protein is uncommonly effective at promoting the solubility of polypeptides to which it is fused". Protein Sci 8 (8): 1668–1674. PMC 2144417. PMID 10452611. doi:10.1110/ps.8.8.1668. 
  30. Waugh, DS (2016). "Crystal structures of MBP fusion proteins". Protein Sci 25 (3): 559–571. PMID 26682969. doi:10.1002/pro.2863. 

Véxase taménEditar

Outros artigosEditar

Ligazóns externasEditar