Cromosoma artificial bacteriano

O cromosoma artificial bacteriano (CAB ou, en inglés, BAC) é un vector de clonación usado para clonar fragmentos de ADN (de 100 a 300 kb de tamaño; como media 150 kb)^[1] na bacteria Escherichia coli, creado a partir do plásmido factor F encontrado de modo natural na mencionada bacteria^[2]^[3].

É un dos tipos de vectores de clonación coñecidos como "vectores de alta capacidade", entre os que ademais se inclúen os cósmidos, PACs (cromosoma artificial derivado do ADN do bacteriófago P1) e YACs (cromosoma artificial de lévedo), por contraposición cos "vectores de baixa capacidade", como plásmidos, vectores derivados do fago lambda, faxémidos e fósmidos.

Os cromosomas artificiais bacterianos son moi utilizados como vectores de clonación para a construción de xenotecas (bibliotecas xenómicas), como no Proxecto Xenoma Humano. A súa frecuente utilización débese á súa notable capacidade, grande estabilidade e baixa porcentaxe de quimerismo. Tamén se usan no estudo de enfermidades hereditarias e para a clonación de xenomas de axentes infecciosos como virus^[4]^[5]^[6].

Dado o gran tamaño dos CAB (ou BAC) recombinantes, as estratexias para a súa introdución na célula máis eficientes son as que utilizan a electroporación (aplícanse correntes eléctricas á membrana celular para que se formen poros que permitan o paso de substancias).

Un cromosoma artificial bacteriano típico consta de:

OriS: orixe de replicación do factor F
repE: control da replicación do plásmido
parA, B, C: control da replicación
CMr: cloranfenicol acetil-transferase (CAT) (xene de resistencia ao cloranfenicol)
LacZ’: xene cun polilinker (que contén múltiples sitios de restrición) no seu interior. Utilízase para o ensaio de alfa-complementación.

Procedemento de clonación editar

Para realizar a clonación dun xene hai que seguir o seguinte procedemento:

a) Córtase o vector co encima de restrición HindIII para abrir o plásmido e facelo liñal.
b) Desfosforílanse os extremos 5’ do vector para evitar a autoligación.
c) Dixírese a nosa mostra con HindIII ou outro encima compatible. Selecciónanse os fragmentos segundo o seu tamaño por electroforese e purifícanse.
d) Lévase a cabo a reacción de ligación.
e) Transfírense os vectores a unha célula por electroporación.
f) Selección dos clons nun medio con cloranfenicol e X-gal. Son positivos os que sobreviven en cloranfenicol e carecen de actividade de beta-galactosidase.

Notas editar

↑ Stone NE, Fan J-B, Willour V, Pennacchio LA, Warrington JA, Hu A, Chapelle A, Lehesjoki A-E, Cox DR, Myers RM (1996). "Construction of a 750-kb bacterial clone contig and restriction map in the region of human chromosome 21 containing the progressive myoclonus epilepsy gene". Genome Research 6 (3): 218–225. PMID 8963899. doi:10.1101/gr.6.3.218.
↑ O'Connor M, Peifer M, Bender W (1989). "Construction of large DNA segments in Escherichia coli". Science 244 (4910): 1307–1312. PMID 2660262. doi:10.1126/science.2660262.
↑ Shizuya H, Birren B, Kim U-J, Mancino V, Slepak T, Tachiiri Y, Simon M (1992). "Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector". Proc Natl Acad Sci USA 89 (18): 8794–8797. PMC 50007. PMID 1528894. doi:10.1073/pnas.89.18.8794.
↑ Almazan F, Gonzalez JM, Penzes Z, Izeta A, Calvo E, Plana-Duran J, Enjuanes L (2000). "Engineering the largest RNA virus genome as an infectious bacterial artificial chromosome". Proc Natl Acad Sci USA 97 (10): 5516–5521. PMC 25860. PMID 10805807. doi:10.1073/pnas.97.10.5516.
↑ Domi A, Moss B (2002). "Cloning the vaccinia virus genome as a bacterial artificial chromosome in Escherichia coli and recovery of infectious virus in mammalian cells". Proc Natl Acad Sci USA 99 (19): 12415–12420. PMC 129459. PMID 12196634. doi:10.1073/pnas.192420599.
↑ Messerle M, Crnkovic I, Hammerschmidt W, Ziegler H, Koszinowski UH (1997). "Cloning and mutagenesis of a herpesvirus genome as an infectious bacterial artificial chromosome". Proc Natl Acad Sci USA 94 (26): 14759–14763. PMC 25110. PMID 9405686. doi:10.1073/pnas.94.26.14759.

Véxase tamén editar

Ligazóns externas editar

Biblioteca BAC
The Big Bad BAC: Bacterial Artificial Chromosomes — a review from the Science Creative Quarterly
Empire Genomics (compañía que vende clons de BAC de librarías xenómicas)
Amplicon Express (compañía que fabrica bibliotecas de BAC personalizadas)

Outros artigos editar

Cromosoma artificial humano (CAH ou HAC)
Cromosoma artificial de lévedos (YAC)

[Stone1996-1] Stone NE, Fan J-B, Willour V, Pennacchio LA, Warrington JA, Hu A, Chapelle A, Lehesjoki A-E, Cox DR, Myers RM (1996). "Construction of a 750-kb bacterial clone contig and restriction map in the region of human chromosome 21 containing the progressive myoclonus epilepsy gene". Genome Research 6 (3): 218–225. PMID 8963899. doi:10.1101/gr.6.3.218.

[OConnor1989-2] O'Connor M, Peifer M, Bender W (1989). "Construction of large DNA segments in Escherichia coli". Science 244 (4910): 1307–1312. PMID 2660262. doi:10.1126/science.2660262.

[Shizuya1992-3] Shizuya H, Birren B, Kim U-J, Mancino V, Slepak T, Tachiiri Y, Simon M (1992). "Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector". Proc Natl Acad Sci USA 89 (18): 8794–8797. PMC 50007. PMID 1528894. doi:10.1073/pnas.89.18.8794.

[Almazan2000-4] Almazan F, Gonzalez JM, Penzes Z, Izeta A, Calvo E, Plana-Duran J, Enjuanes L (2000). "Engineering the largest RNA virus genome as an infectious bacterial artificial chromosome". Proc Natl Acad Sci USA 97 (10): 5516–5521. PMC 25860. PMID 10805807. doi:10.1073/pnas.97.10.5516.

[Domi2002-5] Domi A, Moss B (2002). "Cloning the vaccinia virus genome as a bacterial artificial chromosome in Escherichia coli and recovery of infectious virus in mammalian cells". Proc Natl Acad Sci USA 99 (19): 12415–12420. PMC 129459. PMID 12196634. doi:10.1073/pnas.192420599.

[Messerle1997-6] Messerle M, Crnkovic I, Hammerschmidt W, Ziegler H, Koszinowski UH (1997). "Cloning and mutagenesis of a herpesvirus genome as an infectious bacterial artificial chromosome". Proc Natl Acad Sci USA 94 (26): 14759–14763. PMC 25110. PMID 9405686. doi:10.1073/pnas.94.26.14759.

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]