Faloidina

composto químico

A faloidina é un composto que pertence a unha clase de toxinas chamadas falotoxinas, que se encontran no fungo Amanita phalloides. É un hexapéptido bicíclico ríxido que é mortal poucos días despois de ser inxectado no torrente sanguíneo. O principal síntoma do envelenamento por faloidina é sentir unha gran fame debido á destrución das células do fígado. Funciona uníndose e estabilizando a proteína actina filamentosa (actina F ou F-actina) e impedindo a despolimerización das fibras de actina. Debido á súa unión forte e selectiva coa actina F, os derivados da faloidina que levan etiquetas fluorescentes utilízanse moito en microscopía para visualizar a actina F en investigacións biomédicas. Aínda que a faloidina é moi tóxica para as células hepáticas, engade pouca toxicidade adicional á que teñen outros compoñentes da Amanita phalloides, xa que non se absorbe no tracto dixestivo.

Faloidina
Identificadores
Número CAS 17466-45-4
PubChem 441542
ChemSpider 28467534
ChEBI CHEBI:8040
Imaxes 3D Jmol Image 1
Propiedades
Fórmula molecular C35H48N8O11S
Masa molar 788,87 g mol−1
Aspecto Acicular
Punto de fusión 281 °C; 538 °F; 554 K

Se non se indica outra cousa, os datos están tomados en condicións estándar de 25 °C e 100 kPa.
A Amanita phalloides contén faloidina, aínda que non é o seu principal veleno.

DescubrimentoEditar

A faloidina foi un dos primeiros péptidos cíclicos que se descubriron. Foi illado da Amanita phalloides e cristalizado por Feodor Lynen e Ulrich Wieland[1] en 1937.[2] A súa estrutura é pouco común porque contén un enlace cisteína-triptófano que orixina un hexapéptido bicíclico. Este enlace non fora atopado antes e fai que determinar a estrutura da faloidina sexa bastante máis difícil que a doutros péptidos. Estes investigadores determinaron a presenza dun átomo de xofre usando espectroscopía UV. Os experimentos con níquel de Raney confirmaron a presenza de xofre no anel do triptófano. Atoparon que o triptófano desulfurado seguía sendo circular, o cal demostraba que a estrutura da faloidina é normalmente bicíclica. Unha vez linearizado, puido determinarse a secuencia de aminoácidos da faloidina desulfurizada por degradación de Edman, traballo feito por T. Wieland e W. Schön en 1955.[3]

Debido á súa alta afinidade pola actina, descubriuse o seu uso potencial como reactivo de tinguidura ou marcaxe para a visualización da actina en microscopía. Os derivados conxugados con fluoróforos son un produto moi vendido para laboratorios. Debido á súa capacidade de unirse selectivamente á actina filamentosa (actina F) e non aos monómeros de actina (actina G), a faloidina etiquetada fluorescentemente é máis efectiva que os anticorpos contra a actina.[4]

SínteseEditar

BiosínteseEditar

A faloidina é un hexapéptido bicíclico que contén un enlace pouco frecuente cisteína-triptófano. O xene que codifica a faloidina forma parte da familia MSDIN de xenes da A. phalloides e codifica un propéptido de 34 aminoácidos. Un residuo de prolina flanquea a rexión de sete residuos que posteriormente constituirá a faloidina. Despois da tradución, o péptido debe ser escindido proteoliticamente, ciclado, hidroxilado, formarse o enlace Trp-Cys para orixinar triptationina, e epimerizado para formar D-Thr. A orde o mecanismo bioquímico exacto destes pasos non se coñece completamente. O que se cre actualmente é que os xenes necesarios para a biosíntese están agrupados preto dos xenes MSDIN.[5]

A primeira modificación postraducional do péptido de 34 aminoácidos é a clivaxe proteolítica por medio dunha prolil oligopeptidase (POP) que elimina o péptido líder de 10 aminoácidos. Despois, a POP cicla o hexapéptido Ala-Trp-Leu-Ala-Thr-Cys-Pro por transpeptidación entre o aminoácido 1 (Ala) e o 7 (Pro). Crese que a formación de triptationina por medio do enlace cruzado Trp-Cys ocorre a continuación.[5]

Síntese químicaEditar

Como a faloidina se utiliza pola súa capacidade de unirse e estabilizar os polímeros de actina pero as células non poden captala doadamente, os derivados da faloidina demostraron ser máis útiles no laboratorio. Esencialmente, segue a síntese típica dun pequeno péptido, usando hidroxilprolina. A principal dificultade na síntese é a formación do enlace da triptationina (cisteína-triptófano).

Máis abaixo móstrase o mecanismo sintético xeral levado a cabo por Anderson et al. en 2005 para a síntese en fase sólida de ala7-faloidina, que difire no residuo 7 da faloidina como se indica na imaxe.[6] THPP significa linker de tetrahidropiranil polistireno, que se utiliza para conectar a molécula co soporte sólido durante a síntese. Nótese que a síntese mostrada é simplemente un esquema xeral para indicar a orde de formación de enlaces para unir os materiais de partida. A ala7-faloidina e outras variantes similares da faloidina son útiles para incrementar a captación na célula da floidina e para unir a eles un fluoróforo que favoreza a visualización da actina F en microscopía.

A primeira síntese total da faloidina conseguiuse pola combinación da síntese en fase sólida e en fase de solución (Baosheng Liu e Jianheng Zhang, Patente dos Estados Unidos, US 8,569,452 B2). As propiedades físicas e químicas da faloidina sintética son as mesmas que as da natural.

Mecanismo de acciónEditar

A faloidina únese á actina F, impedindo a súa polimerización e envelenando a célula. A faloidina únese especificamente á interface entre as subunidades da actina F, unindo fortemente as subunidades adxacentes. A faloidina, un heptapéptido biciclico, únese aos filamentos de actina moito máis fortemente que aos monómeros de actina, o que leva a unha diminución na constante de disociación das subunidades de actina dos extremos dos filamentos, que estabiliza esencialmente os filamentos de actina impedindo a despolimerización de filamentos.[7] Ademais, a faloidina inhibe a actividade de hidrólise de ATP da actina F.[8] Así, a faloidina atrapa os monimeros de actina nunha conformación distinta da propia da actina G e estabiliza a estrutura da actina F ao reducir grandemente a constante de disociación dos monómeros, un evento asociado co atrapamento de ADP.[8] Overall, phalloidin is found to react stoichiometrically with actin, strongly promote actin polymerization, and stabilize actin polymers.[9]

A faloidina funciona de forma diferente segundo a súa concentración na célula. Cando se introduciu no citoplasma en baixas concentracións, a faloidina recruta as formas menos polimerizadas da actina citoplásmica e a filamina en "illas" estables de polímeros de actina agregados, aínda que non interfire coas fibras de estrés, é dicir, os grosos feixes de microfilamentos.[9] Wehland et al. tamén sinalaron que a maiores concentracións, a faloidina induce a contracción celular.

SíntomasEditar

Pouco despois do seu descubrimento, fixéronse experimentos nos que se inxectou faloidina a ratos e descubriuse que a súa LD50 é de 2 mg/kg por vía intraperitoneal (IP). Cando os ratos se expoñen á dose letal mínima tardan varios días en morrer. O único efecto lateral aparente do envelenamento por faloidina é ter unha gran fame. Isto prodúcese porque a faloidina só é captada polo fígado por medio de proteínas de transporte de membrana de sales biliares.[10] Unha vez dentro do fígado, a faloidina únese á actina F, impedindo a súa despolarización. Este proceso require un tempo para que destrúan as células hepáticas. Os riles poden tamén captar faloidina, pero non tan eficazmente coma o fígado, e neles a faloidina causa nefrose.[11]

Uso para a obtención de imaxesEditar

 
Faloidina fluorescente (vermella) marcando filamentos de actina nunha célula endotelial.

As propiedades da faloidina fan que sexa unha útil ferramenta para investigar a distribución da actina F nas células etiquetando a faloidina con análogos fluorescentes e usándoos para tinguir os filamentos de actina en microscopía óptica. Os derivados fluorescentes da faloidina fixéronse enormemente útiles para localizar os filamentos de actina nas células vivas ou fixadas e para visualizar os filamentos de actina in vitro.[7] Desenvolveuse unha técnica de alta resolución para detectar a actina F aos niveis necesarios para a microscopía óptica e electrónica utilizando faloidina conxugada co fluoróforo eosina, que actúa como etiqueta fluorescente.[12] Neste método coñecido como fotooxidación de fluorescencia, as moléculas fluorescentes poden utilizarse para dirixir a oxidación de diaminobencidina (DAB) para xerar un produto de reacción que pode facerse denso aos electróns e detectable por microscopía electrónica.[12] A cantidade de fluorescencia visualizada pode usarse como unha medida cuantitativa da cantidade de actina filamentosa que hai nas células se se usan cantidades saturantes de faloidina fluorescente.[7] En consecuencia, a microscopía fluorescente xunto coa microinxección de faloidina pode utilizarse para avaliar as funcións directas e indirectas da actina citoplásmica nos seus diferentes estadios de formación de polímero.[9] Por tanto, a faloidina fluorescente é unha ferramaneta útil no estudo das redes de actina a alta resolución.

Usos e limitaciónsEditar

 
Imaxe de deconvolución de células U2OS tinguidas con faloidina fluorescente tomadas con microscopio confocal.

A faloidina é moito máis pequena que un anticorpo como os que tipicamente se usarían para etiquetar proteíans celulares para microscopia de fluorescencia, e permite un etiquetado moito máis denso de actina filamentosa, polo que pode obterse unha imaxe moito máis detallada a maiores resolucións.

As faloidinas non modificadas non permean a membrana, polo que so menos efectivas en experimentos con células vivas. Porén, sintetizáronse derivados da faloidina nos que se observa unha moita maior permeabilidade celular.

As células tratadas con faloidinas mostran varios efectos tóxicos e frecuentemente morren.[7] Ademais, é importante indicar que as células tratadas con faloidina van ter niveis moito maiores de actina asociada coa membrana plasmática, e a microinxección de faloidina en células vivas cambia a distirbución da actina e a motilidade celular.[7]

NotasEditar

  1. G. Semenza, E.C. Slater, R. Jaenicke. Selected Topics in the History of Biochemistry. Personal Recollections - Google books
  2. Lynen F, Wieland U (18 November 1937). "Uber die Giftstoffe des Knollenblätterpilzes. IV". Justus Liebigs Annalen der Chemie (en alemán) 533 (1): 93–117. doi:10.1002/jlac.19385330105. 
  3. Wieland T, Schon W (16 January 1955). "Über die Giftstoffe des grünen Knollenblätterpilzes X. Mitteilung. Die Konstitution des Phalloidins". Justus Liebigs Annalen der Chemie 593 (2): 157–178. doi:10.1002/jlac.19555930204. 
  4. Immunohistochemistry: Basics and Methods. Springer Science & Business Media. 2010. pp. 92–3. ISBN 978-3-642-04609-4. 
  5. 5,0 5,1 Walton JD; Hallen-Adams He; Luo H (4 August 2010). "Ribosomal biosynthesis of the cyclic peptide toxins of Amanita mushrooms". Peptide Science 94 (5): 659–664. PMC 4001729. PMID 20564017. doi:10.1002/bip.21416. 
  6. Anderson MO, Shelat AA, Kiplan Guy R (16 April 2005). "A solid-phase approach to the phallotoxins: total synthesis of [ala7]-phalloidin". J. Org. Chem. 70 (12): 4578–84. PMID 15932292. doi:10.1021/jo0503153. 
  7. 7,0 7,1 7,2 7,3 7,4 Cooper JA (October 1987). "Effects of cytochalasin and phalloidin on actin". J. Cell Biol. 105 (4): 1473–8. PMC 2114638. PMID 3312229. doi:10.1083/jcb.105.4.1473. 
  8. 8,0 8,1 Barden JA, Miki M, Hambly BD, Dos Remedios CG (February 1987). "Localization of the phalloidin and nucleotide-binding sites on actin". Eur. J. Biochem. 162 (3): 583–8. PMID 3830158. doi:10.1111/j.1432-1033.1987.tb10679.x. 
  9. 9,0 9,1 9,2 Wehland J, Osborn M, Weber K (December 1977). "Phalloidin-induced actin polymerization in the cytoplasm of cultured cells interferes with cell locomotion and growth". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (12): 5613–7. PMC 431831. PMID 341163. doi:10.1073/pnas.74.12.5613. 
  10. Wieland T (1963). "Chemical and toxicological studies with cyclopeptides of Amanita phalloides". Pure and Applied Chemistry 3 (6): 339–350. doi:10.1351/pac196306030339. 
  11. Schröder, Eberhard; Lübke, Klaus (2014). The Peptides, Volume II: Synthesis, Occurrence, and Action of Biologically Active Polypeptides. Elsevier. p. 475. ISBN 978-1-4832-5986-4.  Focuses on the synthesis of biologically active polypeptides and analogues.
  12. 12,0 12,1 Capani F, Deerinck TJ, Ellisman MH, Bushong E, Bobik M, Martone ME (1 November 2001). "Phalloidin-eosin followed by photo-oxidation: a novel method for localizing F-actin at the light and electron microscopic levels". J. Histochem. Cytochem. 49 (11): 1351–61. PMID 11668188. doi:10.1177/002215540104901103. Arquivado dende o orixinal o 16 de abril de 2005. Consultado o 27 de xuño de 2019.