Secuenciación de Maxam e Gilbert

A secuenciación de Maxam e Gilbert é un método de secuenciación de ADN desenvolvido por Allan Maxam e Walter Gilbert en 1976–1977. Este método está baseado en modificacións químicas do ADN específicas de nucleobase e a rotura subseguinte do esqueleto da molécula de ADN en sitios adxacentes aos nucleótidos modificados.

Un exemplo da reacción de secuenciación de Maxam e Gilbert. Cortar o mesmo segmento etiquetado do ADN en diferentes puntos rende fragmentos etiquetados de diferentes tamaños. Os fragmentos poden despois ser separados por electroforese en xel.

A secuenciación de Maxam e Gilbert foi o primeiro método amplamente utilizado de secuenciación de ADN, e, xunto coa secuenciación polo método didesoxi de Sanger, representa a primeira xeración dos métodos de secuenciación do ADN. Porén, a secuenciación de Maxam e Gilbert xa non ten un uso amplo, ao ser substituída por métodos de secuenciación de seguinte xeración.

Historia

Aínda que Maxam e Gilbert publicaron o seu método de secuenciación química dous anos despois de que Frederick Sanger e Alan Coulson publicasen o seu traballo sobre secuenciación máis-menos, A secuenciación de Maxam e Gilbert fíxose rapidamente máis popular, xa que o ADN purificado podía usarse directamente, mentres que o método de Sanger inicial requiría que cada lectura fose clonada para a produción de ADN monocatenario. Porén, coa mellora que supuxo o método de terminación de cadea de Sanger (véxase máis abaixo), a secuenciación de Maxam e Gilbert perdeu o favor dos investigadores debido á súa complexidade técnica que prohibía o seu uso nos equipamentos de bioloxía molecular estándar, o amplo uso de compostos químicos perigosos e as dificultades para aumentar a escala de aplicación.

O artigo de Allan Maxam e Walter Gilbert de 1977 “A new method for sequencing DNA” foi honrado pola Citation for Chemical Breakthrough Award da División de Historia da Química da Sociedade Química Americana en 2017. Foi presentado ao Departamento de Bioloxía Molecular e Celular, da Universidade de Harvard.

Procedemento

A secuenciación de Maxam e Gilbert require a etiquetaxe radioactiva nun extremo 5′ do fragmento de ADN para ser secuenciado (tipicamente por unha reacción de quinase usando gamma-³²P ATP) e a purificación do ADN. O tratamento químico xera roturas nunha pequena proporción dun ou dúas das catro bases nucleotídicas en cada unha das catro reaccións (G, A+G, C, C+T). Por exemplo, as purinas (A+G) son despurinadas usando ácido fórmico, as guaninas (e en certa extensión as adeninas) son metiladas por dimetil sulfato e as pirimidinas (C+T) son hidrolizadas usando hidracina. A adición de sal (cloruro de sodio) á reacción da hidracina inhibe a reacción da timina para a reacción de só C. Os ADN modificados poden despois ser clivados por piperidina quente; (CH₂)₅NH na posición da base modificada. A concentración dos compostos químicos modificados é controlada para introducir como media unha modificación por molécula de ADN. Así, xérase unha serie de fragmentos etiquetados, desde o extremo radioetiquetado do primeiro sitio de "corte" en cada molécula.

Os fragmentos nas catro reaccións son sometidos a electroforese en xel un ao lado do outro en xeles desnaturalizantes de poliacrilamida para a súa separación por tamaños. Para visualizar os fragmentos, o xel é exposto á película de raios X para a autorradiografía, rendendo unha serie de bandas escuras cada unha das cales mostra a localización de moléculas de ADN radioetiquetadas idénticas. A partir da presenza e ausencia de certos fragmentos pode inferirse a secuencia.

Métodos relacionados

Esta método levou ao Ensaio de Interferencia de Metilación, usado para mapar os sitios de unión ao ADN para proteínas que se unen ao ADN.

En 1994 desenvolveuse un protocolo de secuenciación de Maxam e Gilbert automatizado.