Southern blot: Diferenzas entre revisións
Contido eliminado Contido engadido
m →Ligazóns externas: Arranxos varios + cda |
Sen resumo de edición |
||
Liña 24:
# '''Tratamento do xel previo á transferencia (alcalino)'''. Se se utilizan métodos de transferencia alcalina, o xel de ADN colócase na solución alcalina (que xeralmente contén [[hidróxido de sodio]]) para que se desnaturalice (separe) a [[dobre hélice]] do ADN. A desnaturalización nun ambiente alcalino pode mellorar a unión dos residuos de [[timina]] cargados negativamente do ADN a grupos amino cargados positivamente da membrana, separándoo en febras monocatenarias de ADN para posteriormente [[hibridación de ácidos nucleicos|hibridalo]] á sonda (ver máis abaixo), á vez que destrúe calquera ARN residual que puidese estar aínda presente no ADN. Tamén se poden elixir métodos de transferencia neutra en vez da alcalina.
[[Ficheiro:blot biology.svg|miniatura|dereita|Principio da transferencia de moléculas no Southern blot e outras técnicas de transferencia.]]
# '''Transferencia á membrana'''. Sitúase unha lámina de membrana de [[nitrocelulosa]] (ou, alternativamente de [[nailon]]) na parte superior do xel (ou debaixo dependendo da dirección da transferencia). Aplícase uniformemente presión ao xel (usando succión ou situando unha morea de toallas de papel cun peso encima da membrana e o xel), para asegurar un contacto bo e uniforme entre o xel e a membrana. Se se fai a transferencia por succión, úsase o tampón [[tampón SSC|20X SSC]] para asegurar o selado e impedir o secado do xel. Despois úsase o [[solución tampón|tampón]] para transferir por [[capilaridade]] desde a rexión de alto [[potencial hídrico]] á rexión de baixo potencial hídrico (xeralmente tecidos de papel e papel de filtro) para transferir o ADN desde o xel á membrana. O ADN únese á membrana por interaccións de [[intercambio iónico]] debido á carga negativa do ADN e a positiva da membrna.
# '''Quentamento da membrana'''. A membrana é entón quentada ao baleiro nun forno de baleiro ou normal a 80 °C durante 2 horas (en condicións estándar, con nitrocelulosa ou membrana de nailon) ou é exposta a [[radiación ultravioleta]] (con membrana de nailon) para que o ADN transferido quede unido permanentemente á membrana.
# '''Hibridación coa sonda'''. A membrana é despois exposta a unha sonda de hibridación, que é un fragmento de ADN monocatenario cunha secuencia específica cuxa presenza no ADN diana debe determinarse. A sonda de ADN está etiquetada para que poida detectarse, xeralmente incorporándolle marcaxe [[radioactividade|radioactiva]] ou [[fluorescencia|fluorescente]] ou unha [[hibridación in situ cromoxénica|tinguidura cromoxénica]]. Nalgúns casos, a sonda de hibridación pode ser de ARN en vez de ADN. Para segurar a especificidade da unión da sonda ao ADN da mostra, os métodos de hibridación máis comúns usan ADN de esperma de [[Salmo (xénero)|salmón]] ou de [[arenque]] para bloquear a superficie da membrana e o ADN diana, [[formamida]] desionizada, e [[deterxente]]s como o [[dodecil sulfato sódico|SDS]] para reducir a unión non específica da sonda.
| |||