SDD-AGE son as siglas en inglés de Semi-Denaturating Detergent Agarose Gel Electrophoresis ou electroforese en xel de agarosa con deterxente semidesnaturalizante. É un método para detectar e caracterizar grandes polímeros de proteínas que son estables en SDS ao 2% a temperatura dunha habitación, a diferenza da maioría dos grandes complexos proteicos. Este método é moi útil para estudar prións e amiloides, que se caracterizan pola formación de polímeros proteináceos.[1][2][3][4][5][6] A agarosa é utilizada para facer o xel, xa que os polímeros resistentes ao SDS son grandes (da orde de 200-4000+ kDa) e non poden entrar no xel de poliacrilamida convencional, que ten poros pequenos. A agarosa, por outra parte, ten grandes poros, o que permite a separación dos polímeros.

Exemplo do resultado dun western blot despois dunha separación electroforética SDD-AGE, marcado con anticorpos específicos.

O uso deste método permitiu aos investigadores comprender que existían polo menos algúns tipos de agregados de prións nunha estrutura en dous niveis, as proteínas agrupadas en polímeros, que son moi estables e resisten o tratamento cun SDS ao 2% a temperatura dunha habitación, e agregados, que son feixes de polímeros, que se disocian baixo estas condicións.

As diferenzas no tamaño dos polímeros poden indicar a eficiencia da fragmentación de polímeros in vivo.

Historia editar

O método creouse no laboratorio de xenética molecular do Instituto de Investigación Cardiolóxica Ruso e foi publicado en 2003 por Kryndushkin et al.[1] O método orixinal usaba o sistema de tamponamento TAE e incorporaba un sistema de blotting ao baleiro modificado para a transferencia de proteínas nunha membrana (orixinalmente PVDF). O sistema de blotting ao baleiro modificado é en realidade unha transferencia de capilaridade axudada polo baleiro, xa que o baleiro só axuda a que o fluído que xa pasou polo xel e a membrana saia do sistema.

Variacións editar

Utilizáronse tamén outras modificacións, como a descrita por Bagriantsev et al.,[7] que usa a tradicional transferencia húmida e o sistema de tamponamento TGB, e outras que usan a transferencia semiseca ou transferencia de capilaridade.[8]

Notas editar

  1. 1,0 1,1 Kryndushkin DS; Alexandrov IM; Ter-Avanesyan MD; Kushnirov VV (2003). "Yeast [PSI+] prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hsp104". Journal of Biological Chemistry 278 (49): 49636–43. PMID 14507919. doi:10.1074/jbc.M307996200. 
  2. Salnikova AB; Kryndushkin DS; Smirnov VN; Kushnirov VV; Ter-Avanesyan MD (2005). "Nonsense suppression in yeast cells overproducing Sup35 (eRF3) is caused by its non-heritable amyloids". Journal of Biological Chemistry 280 (10): 8808–12. PMID 15618222. doi:10.1074/jbc.M410150200. 
  3. Meriin AB; Zhang X; Alexandrov IM; Salnikova AB; Ter-Avanesian MD; Chernoff YO; Sherman MY (2007). "Endocytosis machinery is involved in aggregation of proteins with expanded polyglutamine domains". FASEB Journal 21 (8): 1915–25. PMID 17341688. doi:10.1096/fj.06-6878com. 
  4. Shkundina IS; Kushnirov VV; Tuite MF; Ter-Avanesyan MD (2006). "The role of the N-terminal oligopeptide repeats of the yeast Sup35 prion protein in propagation and transmission of prion variants". Genetics 172 (2): 827–35. PMC 1456247. PMID 16272413. doi:10.1534/genetics.105.048660. 
  5. Alexandrov IM; Vishnevskaya AB; Ter-Avanesyan MD; Kushnirov VV (2008). "Appearance and propagation of polyglutamine-based amyloids in yeast: tyrosine residues enable polymer fragmentation". Journal of Biological Chemistry 283 (22): 15185–92. PMC 2397454. PMID 18381282. doi:10.1074/jbc.M802071200. 
  6. Alberti S; Halfmann R; King O; Kapila A; Lindquist S (2009). "A systematic survey identifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins". Cell 137 (1): 146–58. PMC 2683788. PMID 19345193. doi:10.1016/j.cell.2009.02.044. 
  7. Bagriantsev SN; Kushnirov VV; Liebman SW (2006). "Analysis of amyloid aggregates using agarose gel electrophoresis". Methods in Enzymology 412: 33–48. ISBN 9780121828172. PMID 17046650. doi:10.1016/S0076-6879(06)12003-0. 
  8. Halfmann R; Lindquist S (2008). "Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis". Journal of Visualized Experiments (17). PMC 2723713. PMID 19066511. doi:10.3791/838.