Transformación xenética: Diferenzas entre revisións

En [[bioloxía molecular]] denomínase '''transformación''' á alteración xenética dunha célula como resultado da captación a través da membrana celular, incorporación e expresión de material xenético exóxeno ([[ADN exóxeno]]) do medio que a rodea. A transformación ten lugar de forma natural nalgunhas especies de [[bacteria]]s (transformación bacteriana), pero pode tamén efectuarse por medios artificiais noutras células. Para que se produza a transformación, as bacterias deben estar nun estado chamado ''competente'' ou de ''competencia'', que pode acontecer como unha resposta por tempo limitado ás condicións ambientais como escaseza de nutrientes e densidade celular. A transformación é un dos tres procesos polos cales o material xenético exóxeno pode introducirse nunha célula bacteriana; os outros dous son a [[conxugación bacteriana]] (na que as células transfiren ADN por contacto directo) e a [[transdución xenética|transdución]] (na que un virus transporta xenes dunha bacteria a outra). O termo "transformación" pode utilizarse tamén para describir a inserción de novo material xenético en células non bacterianas, como fungos, plantas e animais, pero especialmente para os animais prefírese usar o termo transfección para non confundila coa "transformación" celular que ten lugar durante o [[Cancro|cáncer]]. A introdución de ADN alleo en [[célula eucariota|células eucariotas]] denomínase "[[transfección]]". <ref>{{Cita libro |title=Molecular Biology of the Cell |last=Alberts |first= Bruce|authorlink=Bruce Alberts |coauthors= ''et al.''|year= 2002|publisher= Garland Science|location= New York|isbn= 978-0-8153-4072-0|page=G:35}}</ref>

A transformación foi descuberta en 1928 polo bacteriólogo británico [[Frederick Griffith]]. Griffith estaba traballando co ''[[Streptococcus pneumoniae]]'', bacteria que ten dúas cepas, unha virulenta ou S e outra non virulenta ou R. Griffith descubriu que a cepa non virulenta de ''[[Streptococcus pneumoniae]]'' podía ser transformada en virulenta se a mesturábamos con bacterias da cepa virulenta mortas por calor. Griffith supuxo que algún "principio transformante" pasaba das células mortas virulentas ás células vivas non virulentas, que dese modo se ''transformaban'' en virulentas, pero non puido identificar que substancia era o principio transformador. En 1944 [[Oswald Avery]], [[Colin MacLeod]], e [[Maclyn McCarty]] identificaron o principio transformador como o ADN, o que serviu para demostrar que o ADN é a molécula que contén a información xenética nas células (o que ata entón se poñía en dúbida). Parte do ADN dos ''Streptococcus'' S pasaba ás células R, provocando a transformación. <ref>{{Cita libro|title = The Transformation of Genetics by DNA: An Anniversary Celebration of AVERY, MACLEOD and MCCARTY(1944) in ''Anecdotal, Historical and Critical Commentaries on Genetics'' | last = Lederberg | first = Joshua| authorlink = Joshua Lederberg | year= 1994 | publisher = The Rockfeller University, New York, New York 10021-6399 | pmid = 8150273}}</ref>

Pensábase inicialmente que ''[[Escherichia coli]]'', unha bacteria utilizada correntemente como organismo de laboratorio, non podía experimentar transformación. Porén, en 1970, Morton Mandel e Akiko Higa demostraron que ''[[E. coli]]'' pode ser inducida a captar ADN do [[fago lambda|bacteriófago λ]] sen ter que utilizar [[fago axudante|fagos axudantes]] despois de ser tratada con solucións de [[cloruro de calcio]]. <ref>{{Cita publicación periódica|doi = 10.1016/0022-2836(70)90051-3 |title = Calcium-dependent bacteriophage DNA infection | last = Mandel | first = Morton | coauthors = Higa, Akiko | journal = Journal of Molecular Biology | year= 1970 | url = http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0022283670900513 | volume = 53 |issue = 1 |pages = 159–162|pmid = 4922220}}</ref> Dous anos despois en 1972, Stanley Cohen, Annie Chang e Leslie Hsu demostraron que o tratamento con CaCl₂ é tamén efectivo para a transformación de ADN de plásmidos. <ref>{{Cita publicación periódica|doi = 10.1073/pnas.69.8.2110|title = Nonchromosomal Antibiotic Resistance in Bacteria: Genetic Transformation of Escherichia coli by R-Factor DNA | last = Cohen | first = Stanley | authorlink = Stanley Cohen (biochemist) | coauthors = Chang, Annie and Hsu, Leslie | journal = Proceedings of the National Academy of Sciences | year= 1972 | url = http://www.pnas.org/content/69/8/2110.abstract|pmid = 4559594|volume = 69|issue = 8|pages = 2110–4|pmc = 426879}}</ref> O método de transformación de Mandel e Higa foi despois mellorado por [[Douglas Hanahan]]. <ref> Hanahan, D. (1983). "Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids". Journal of Molecular Biology 166 (4): 557–580. doi:10.1016/S0022-2836(83)80284-8. PMID 6345791. </ref> O descubrimento da existencia de competencia inducida artificialmente en ''E. coli'' proporcionou un eficiente e útil procedemento para provocar a transformación de bacterias, que permitiu simplificar os métodos de [[clonaxe molecular]] en [[biotecnoloxía]] e [[investigación]], e que se converteu nun procedemento de rutina nos laboratorios.

A transformación utilizando [[electroporación]] desenvolveuse a finais da década de 1980, e incrementou a eficiencia da transformación in vitro e o número de cepas bacterianas que se podían transformar. <ref>{{Cita publicación periódica|title = Transformation of various species of gram-negative bacteria belonging to 11 different genera by electroporation | last = Wirth | first = Reinhard | coauthors = Friesenegger, Anita and Fiedlerand, Stefan | journal = Molecular and General Genetics MGG | year= 1989| url = http://www.springerlink.com/content/xx826w544343jt8l/}}</ref> A transformación de células animais e vexetais investigouse no primeiro [[rato transxénico]] que se creou, inxectando un xene dunha hormona de crecemento da rat<u>a</u> nun embrión de rat<u>o</u> en 1982. <ref>{{Cita publicación periódica |title = Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected with metallothionein−growth hormone fusion genes | last = Palmiter| first = Richard | coauthors = Ralph L. Brinster, Robert E. Hammer, Myrna E. Trumbauer, Michael G. Rosenfeld, Neal C. Birnberg & Ronald M. Evans | journal = Nature |volume = 300 |issue = 5893 |pages = 611–5 | year= 1982| url = http://www.nature.com/nature/journal/v300/n5893/abs/300611a0.html |pmid = 6958982 |doi = 10.1038/300611a0}}</ref> En 1907 descubriuse que a bacteria ''[[Agrobacterium tumefaciens]]'' causaba tumores nas plantas, e a principios da década de 1970 descubriuse que o axente indutor de tumores era un [[plásmido]] chamado [[plásmido Ti]]. <ref>{{cite web |last = Nester| first = Eugene | title = Agrobacterium: The Natural Genetic Engineer (100 Years Later) | url = http://www.apsnet.org/publications/apsnetfeatures/Pages/Agrobacterium.aspx | accessdate = 14 January 2011}}</ref> Eliminando os xenes do plásmido que causaban o tumor e engadindo novos xenes os investigadores estiveron en condicións de poder infectar plantas con ''A. tumefaciens'' para que a bacteria inserise o ADN seleccionado nos xenoma das plantas. <ref> Zambryski, P.; Joos, H.; Genetello, C.; Leemans, J.; Montagu, M. V.; Schell, J. (1983). "Ti plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without alteration of their normal regeneration capacity". The EMBO Journal 2 (12): 2143–2150. PMC 555426. PMID 16453482. http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pmcentrez&artid=555426. </ref> Non todas as plantas son susceptibles ás infección por ''A. tumefaciens'' polo que se desenvolveron métodos alternativos como a [[electroporación]] e a [[microinxección]].<ref>{{cite web |last = Peters| first = Pamela | title = Transforming Plants - Basic Genetic Engineering Techniques | url = http://www.accessexcellence.org/RC/AB/BA/Transforming_Plants.php | accessdate = 28 January 2010}}</ref> O bombardeo de partículas fíxose posible coa invención da "pistola (canón, escopeta) de xenes" ou [[biolística]] por [[John C. Sanford|John Sanford]] en 1990. <ref>{{cite web |last = Voiland | first = Michael | coauthors = McCandless, Linda | title = DEVELOPMENT OF THE "GENE GUN" AT CORNELL | url = http://www.nysaes.cornell.edu/pubs/press/1999/genegun.html | accessdate = 28th january 2010}}</ref>

Aproximadamente o 1% das especies bacterianas poden captar de forma natural ADN nas condicións de laboratorio, e máis especies poden captalo nos seus ambientes naturais. O [[ADN]] pode transferirse entre diferentes cepas de bacterias, nun proceso que se denomina [[transferencia horizontal de xenes]]. Algunhas especies cando a célula morre liberan o seu ADN que pode ser captado por outras células, pero a transformación funciona mellor con ADN de especies moi emparentadas. Estas bacterias competentes de forma natural teñen conxuntos de [[xene]]s que proporcionan a maquinaria proteica necesaria para transportar o ADN a través das membranas celulares. O transporte de ADN exóxeno nas células pode requirir proteinas que están implicadas na ensamblaxe de [[pili de tipo IV]] e sistemas de secreción de tipo II (T2SS), xunto cun complexo ADN [[translocase]] na [[membrana plasmática]]. <ref>{{Cita publicación periódica |author=Chen I, Dubnau D |title=DNA uptake during bacterial transformation |journal=Nat. Rev. Microbiol. |volume=2 |issue=3 |pages=241–9 |year=2004 |pmid=15083159 |doi=10.1038/nrmicro844}}</ref>

Debido ás diferenzas de estrutura das envolturas celulares das bacterias [[Gram positiva]]s e [[Gram negativa]]s, hai tamén algunhas diferenzas nos mecanismos da captación do ADN entre estas células, pero a maioría delas comparten características comúns que implican a proteínas relacionadas. O ADN únese primeiro á superficie de células competentes nun receptor do ADN, e pasa a través da membrana plasmática utilizando unha ADN translocase. <ref> Lacks, S.; Greenberg, B.; Neuberger, M. (1974). "Role of a Deoxyribonuclease in the Genetic Transformation of Diplococcus pneumoniae". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 71 (6): 2305–2309. PMC 388441. PMID 4152205. http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pmcentrez&artid=388441.</ref> Só pode atravesar o ADN monocatenario, polo que unha [[nuclease]] degrada a outra cadea durante o proceso, e o ADN monocatenario translocado pode despois integrarse no [[cromosoma bacteriano]] por medio dun proceso dependente de [[RecA]]. Nas células Gram negativas, debido á presenza dunha membrana extra, o ADN require a presenza de canais formados por [[secretina]]s na membrana externa da súa [[parede celular|parede]]. Poden requirirse [[pilina]]s para que exista competencia, pero non está claro. <ref>Long, C. D.; Tobiason, D. M.; Lazio, M. P.; Kline, K. A.; Seifert, H. S. (2003). "Low-Level Pilin Expression Allows for Substantial DNA Transformation Competence in [[Neisseria gonorrhoeae]]". Infection and immunity 71 (11): 6279–6291. PMC 219589. PMID 14573647. http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pmcentrez&artid=219589.</ref> A captación do ADN xeralmente non é específico de secuencia, aínda que nalgunahs especies a presenza de secuencias de captación de ADN específicas pode facilitar a captación eficiente do ADN. <ref> Sisco, K. L.; Smith, H. O. (1979). "Sequence-specific DNA uptake in Haemophilus transformation". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 76 (2): 972–976. PMC 383110. PMID 311478. //www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pmcentrez&artid=383110.</ref>

A competencia artificial pode inducirse por procedementos de laboratorio nos que primeiro hai que facer a célula pasivamente permeable ao ADN ao expoñela a condicións que normalmente non se darían na natureza. <ref>Large-volume transformation with high-throughput efficiency chemically competent cells. Focus 20:2 (1998).</ref> Normalmente o que se fai é incubar as células nunha solución que contén [[catión]]s divalentes, xeralmente unha solución de [[cloruro de calcio]] a temperatura baixa, e despois expoñela a un shock por un pulso de calor. Porén, o mecanismo de captación de ADN por medio da competencia inducida quimicamente por este método de transformación por cloruro de calcio non está claro. A superficie de bacterias como ''E. coli'' está cargada negativamente debido aos [[fosfolípido]]s e [[lipopolisacárido]]s da súa superficie, e o ADN está tamén cargado negativamente (deberían repelerse). Unha das funcións do catión divalente sería apantallar as cargas por coordinación dos fosfatos e outras cargas negativas, o que permitiría que a molécula de ADN se adherise á superficie. Suxeriuse que a exposición das células a catións divalentes en condicións frías pode tamén cambiar ou debilitar a estrutura da superficie celular facéndoa máis permeable ao ADN. O pulso térmico pénsase que crea un desequilibrio térmico entre os dous lados da membrana, que forza ao ADN a entrar na célula por poros celulares ou por zonas danadas da parede celular.

A maioría das especies de [[lévedo]]s, incluíndo ''[[Saccharomyces cerevisiae]]'', poden ser transformados por ADN exóxeno presente no medio natural ou en condicións de laboratorio. Ao expoñer lévedos intactos a [[catión]]s [[alcalino]]s como os de [[cesio]] ou [[litio]] as células poden captar plásmidos de ADN. <ref>{{Cita publicación periódica|last=Ito|first=H|coauthors=Fukuda, Y; Murata, K; Kimura, A|title=Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations.|journal=Journal of bacteriology|date=1983 Jan|volume=153|issue=1|pages=163-8|pmid=6336730}}</ref> Os últimos protocolos adaptan este método de transformación utilizando [[acetato de litio]], [[polietilén glicol]], e ADN monocatenario. <ref>{{Cita publicación periódica|last=Gietz|first=RD|coauthors=Woods, RA|title=Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.|journal=Methods in enzymology|date=2002|volume=350|pages=87-96|pmid=12073338}}</ref> Nestes protocolos, o ADN monocatenario únese preferentemente á parede celular do lévedo, impedindo que o ADN do plásmido faga o mesmo e deixándoo dispoñible para a transformción. <ref>{{Cita publicación periódica|last=Gietz|first=RD|coauthors=Schiestl, RH; Willems, AR; Woods, RA|title=Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure.|journal=Yeast (Chichester, England)|date=1995 Apr 15|volume=11|issue=4|pages=355-60|pmid=7785336}}</ref>

A dixestión encimática, <ref>{{Cita publicación periódica|last=Spencer|first=F.|coauthors=Ketner, G.; Connelly, C.; Hieter, P.|title=Targeted Recombination-Based Cloning and Manipulation of Large DNA Segments in Yeast|journal=Methods|date=1 August 1993|volume=5|issue=2|pages=161–175|doi=10.1006/meth.1993.1021}}</ref> a [[electroporación]], <ref>{{Cita publicación periódica|last=Schiestl|first=Robert H.|coauthors=Manivasakam, P.; Woods, Robin A.; Gietzt, R.Daniel|title=Introducing DNA into Yeast by Transformation|journal=Methods|date=1 August 1993|volume=5|issue=2|pages=79–85|doi=10.1006/meth.1993.1011}}</ref> ou a axitación con partículas de cristal <ref>{{Cita publicación periódica|last=Costanzo|first=MC|coauthors=Fox, TD|title=Transformation of yeast by agitation with glass beads.|journal=Genetics|date=1988 Nov|volume=120|issue=3|pages=667-70|pmid=3066683}}</ref> pode utilizarse tamén para a transformación de células de lévedos.