Wikipedia

Southern blot: Diferenzas entre revisións

Explorar o historial de forma interactiva
← Edición máis vellaEdición máis nova →
Contido eliminado Contido engadido
VisualTexto wiki
Miguelferig (conversa | contribucións)
243.221 edicións
Sen resumo de edición
Miguelferig (conversa | contribucións)
243.221 edicións
Sen resumo de edición
Liña 5:
| journal = [[Journal of Molecular Biology]]| volume = 98| issue = 3| pages = 503–517| issn = 0022-2836| doi = 10.1016/S0022-2836(75)80083-0| pmid = 1195397}}</ref> O Southern blot combina a transferencia de fragmentos de ADN separados por [[electroforese en xel de agarosa|electroforese]] a unha membrana filtrante e a posterior detección dos fragmentos por [[hibridación de sondas]].
 
Outros métodos de [[Blot (bioloxía)|blotting]] ou transferencia, como o [[western blot]],<ref>{{cite journal | last1 = Towbin | first1 = | last2 = Staehelin | first2 = T | last3 = Gordon | first3 = J | display-authors = 3 | last4 = et al | year = 1979 | title = Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications | url = | journal = PNAS | volume = 76 | issue = 9| pages = 4350–4 | doi = 10.1073/pnas.76.9.4350 | pmid = 388439 | pmc=411572}}</ref> [[northern blot]], [[eastern blot]] e [[southwestern blot]], que empregan principios similares, pero usanúsanse [[ARN]] ou [[proteína]]s, foron posteriormente nomeados facendo unha analoxía co nome do Southern blot, aínda que neste caso non se refiren a apelidos, senón á situación xeográfica dos centros onde se inventaron. Os nomes dos outros métodos non hai razón para escribilos con maiúsculas, pero faise tamén moitas veces por analoxía.<ref>{{cite journal
| last = Burnette
| first = W. Neal
Liña 20:
 
== Método ==
# Utilízanse [[endonuclease de restrición|endonucleases de restrición]] para cortar febras de ADN de alto peso molecular en fragmentos máis pequenos.
#Restriction [[endonuclease]]s are used to cut high-molecular-weight DNA strands into smaller fragments.
# Os fragmentos de ADN son despois sometidos a [[electroforese en xel de agarosa]] para separalos por tamaño.
#The DNA fragments are then [[Gel electrophoresis|electrophoresed]] on an [[Agarose gel electrophoresis|agarose gel]] to separate them by size.
# Se algúns dos fragmentos de ADN son maiores de 15 [[par de bases|kb]], entón antes de iniciar o Southern blot, o xel pode tratarse cun ácido, como [[ácido clorhídrico|HCl]] diluído. Este [[Despurinación|despurina]] os fragmentos de ADN, rompéndoo en fragmentos máis pequenos, por tanto, o que facilita unha transferencia máis eficiente desde o xel á membrana.
# If some of the DNA fragments are larger than 15 [[Base pair#Length measurements|kb]], then prior to blotting, the gel may be treated with an acid, such as dilute [[Hydrochloric acid|HCl]]. This [[Depurination|depurinate]]s the DNA fragments, breaking the DNA into smaller pieces, thereby allowing more efficient transfer from the gel to membrane.
# Se se utilizan métodos de transferencia alcalina, o xel de ADN colócase na solución alcalina (que xeralmente contén [[hidróxido de sodio]]) para que se desnaturalice (separe) a [[dobre hélice]] do ADN. A desnaturalización nun entorno alcalino pode mellorar a unión dos residuos de [[timina]] cargados negativamente do ADN a grupos amino cargados positivamente de membrana, separándoo en febras monocatenarias de ADN para posteriormente [[hibridación de ácidos nucleicos|hibridalos]] á sonda (ver máis abaixo), e destrúe calquera ARN residual que puidese estar aínda presente no ADN. Porén, a elección dos métodos de transferencia neutra en vez da alcalina, é a miúdo empírica e pode das resultados equivalentes.{{Citation needed|date=February 2009}}
# If alkaline transfer methods are used, the DNA gel is placed into an alkaline solution (typically containing [[sodium hydroxide]]) to denature the double-stranded DNA. The denaturation in an alkaline environment may improve binding of the negatively charged thymine residues of DNA to a positively charged amino groups of membrane, separating it into single DNA strands for later [[Nucleic acid hybridization|hybridization]] to the probe (see below), and destroys any residual RNA that may still be present in the DNA. The choice of alkaline over neutral transfer methods, however, is often empirical and may result in equivalent results.{{Citation needed|date=February 2009}}
# Sitúase unha lámina de membrana de [[nitrocelulosa]] (ou, alternativaemnte de [[nailon]]) na parte superior (ou debaixo dependendo da dirección da transferencia) do xel. Aplícase uniformemente presión ao xel (usando succión ou situando unha morea de toallas de papel cun peso encima da membrana e o xel), para asegurar un bo e uniforme contacto entre o xelo e a membrana. Se se fai a transferencia por succión, úsase o tampón [[tampón SSC|20X SSC]] para asegurar o selado e impedir o secado do xel. O tampón transfire por [[capilaridade]] desde a rexión de alto [[potencial hídrico]] a unha rexión de baixo potencial hídrico (xeralmente tecidos de papel e papel de filtro) é despois usado paramover o ADN desde o xel á membrana; o ADN únese á membrana por interaccións de [[intercambio iónico]] debido á carga negativa do ADN e a podigtiva da membrna.
# A sheet of [[nitrocellulose]] (or, alternatively, [[nylon]]) [[artificial membrane|membrane]] is placed on top of (or below, depending on the direction of the transfer) the gel. Pressure is applied evenly to the gel (either using suction, or by placing a stack of paper towels and a weight on top of the membrane and gel), to ensure good and even contact between gel and membrane. If transferring by suction, [[SSC buffer|20X SSC]] buffer is used to ensure a seal and prevent drying of the gel. Buffer transfer by [[capillary action]] from a region of high [[water potential]] to a region of low water potential (usually filter paper and paper tissues) is then used to move the DNA from the gel onto the membrane; [[ion exchange]] interactions bind the DNA to the membrane due to the negative charge of the DNA and positive charge of the membrane.
# A membrana é entón quentada ao baleiro nun forno de bsleiro ou normal a 80&nbsp;°C durante 2 horas (condicións estándar; nitrocelulosa ou membrana de nailon) ou é exposta a [[radiación ultravioleta]] (membrana de nailon) para unir permanentemente o ADN transferido á membrana.
# The membrane is then baked in a vacuum or regular oven at 80&nbsp;°C for 2 hours (standard conditions; nitrocellulose or nylon membrane) or exposed to [[ultraviolet radiation]] (nylon membrane) to permanently attach the transferred DNA to the membrane.
# A membrana é despois exposta a unha sonda de hibridación, que é un fragmento de ADN monocatenario cunha secuencia específica cuxa presenza no ADN diana debe determinarse. A sonda de ADN está etiquetada para que poida detectarse, xeralomente incorporándolle marcaxe [[radioactividade|radioactiva]] ou [[fluorescencia|fluorescente]] ou unha [[hibridación in situ cromoxénica|tinguidura cromoxénica]]. Nalgúns casos, a sonda de hibridación pode ser de ARN en vez de ADN. Para segurar a especificidade da unión da sonda á mostra de ADN, os métodos de hibridación máis comúns usan ADN de esperma de [[slalmón]] ou de [[arenque]] para bloquear a superficie da membrana e o ADN diana, [[formamida]] desionizada, e [[deterxente]]s como o [[dodecil slfato sódico|SDS]] para reducir a unión non específica da sonda.
# The membrane is then exposed to a [[hybridization probe]]—a single DNA fragment with a specific sequence whose presence in the target DNA is to be determined. The probe DNA is labelled so that it can be detected, usually by incorporating [[radioactivity]] or tagging the molecule with a [[fluorescence|fluorescent]] or [[Chromogenic in situ hybridization|chromogenic dye]]. In some cases, the hybridization probe may be made from RNA, rather than DNA. To ensure the specificity of the binding of the probe to the sample DNA, most common hybridization methods use salmon or herring sperm DNA for blocking of the membrane surface and target DNA, deionized [[formamide]], and detergents such as [[sodium dodecyl sulfate|SDS]] to reduce non-specific binding of the probe.
# Despois da hibridación, lávase o exceso de sonda da membrana (normalmente usando [[tampón SSC]]), e o patrón de hibridación visualízase cunha película de [[raios X]] por [[autorradiografía]] no caso de sondas radioactivas ou fluorescentes, ou pola aparición de color namembrana se se utiliza o método cromoxénico.
# After hybridization, excess probe is washed from the membrane (typically using [[SSC buffer]]), and the pattern of hybridization is visualized on [[X-ray]] film by [[autoradiography]] in the case of a radioactive or fluorescent probe, or by development of color on the membrane if a chromogenic detection method is used.
 
== Resultados ==
Traído desde «https://gl.wikipedia.org/wiki/Southern_blot»