A técnica de creación de ratos knockout ten algunhas limitacións. A seguinte cita procede dos '' National Institutes of Health'' (Institutos Nacionais da Saúde) dos EEUU e nela discútense varias importantes limitacións desta técnica:<ref>http://www.genome.gov/12514551</ref>
<blockquote>
Aínda que a tecnoloxía dos ratos knockout supón unha valiosa ferramenteferramenta da investigación, ten algunhas importantes limitacións. Arredor do 15 % dos knockouts de xenes son letais no desenvolvemento, o que significa que os embrións alterados xeneticamente non poden crecer orixinando un adulto. Este problema pode xeralmente superarse co uso de [[mutación|mutacións condicionais]]. A falta do rato adulto limita os estudos de desenvolvemento embrionario e normalmente fai máis difícil determinar a función do xene en relación coa saúde humana. Nalgúns casos o xene pode realizar unha función diferente en adultos e nos embrións en desenvolvemento.
