Medio de cultivo

En microbioloxía e biotecnoloxía, un medio de cultivo ou de crecemento é un líquido ou xel deseñado para que nel se fagan crecer colonias de microorganismos ou células,^[1] ou pequenas plantas como os brións Physcomitrella patens.^[2] Hai diferentes tipos de medios para o crecemento de distintos tipos de células.^[3]

Hai dous tipos principais de medios de cultivo: os utilizados para o cultivo celular, que se usan para tipos específicos de células derivadas de plantas ou animais, e os cultivos microbiolóxicos, que se usan para o crecemento de microorganismos, como bacterias ou lévedos. Os medios líquidos poden facerse solidificar orixinando medios semisólidos ou sólidos. Os medios de cultivo máis comúns para microorganismos son os caldos nutritivos e as placas de ágar. Ás veces requírense medios especializados para o crecemento de certos microorganismos e células.^[1] Algúns organismos son máis esixentes e requiren medios especializados debido aos seus complexos requirimentos nutricionais. Os virus e certas bacterias, por exemplo, son parasitos celulares obrigados e requiren medios de crecemento nos que estean presentes células vivas sensibles a eles.

Tipos de medios de cultivo

Os medios de cultivo máis comúns para microorganismos son os caldos nutritivos (medios nutrientes líquidos) ou medio LB. Con frecuencia, os medios líquidos mestúranse con ágar e son vertidos en placas de Petri para que solidifiquen nelas. Estas placas de ágar proporcionan un medio sólido no cal se poden cultivar doadamente os microbios. Permanecen sólidos, xa que moi poucas bacterias poden descompoñer o ágar. Outro método de cultivo son os tubos inclinados. As bacterias que crecen en medios de cultivo líquidos con frecuencia forman suspensións coloidais.

A diferenza entre os medios de cultivo usados para cultivo de células e os usados para cultivos microbiolóxicos é que as células derivadas dun organismo multicelular e postas en cultivo a miúdo non poden crecer sen que se engadan, por exempoo, hormonas ou factores de crecemento, que xeralmente actúan sobre esas células in vivo.^[4] No caso das células animais, esta dificultade soluciónase frecuentemente coa adición ao medio de soro sanguíneo ou un soro sintético de substitución. No caso dos microorganismos, non hai tales limitacións, xa que son normalmente organismos unicelulares. Outra diferenza importante é que as células animais en cultivo fanse crecer normalmente en superficies planas ás que se adhiren, e o medio engádese en forma líquida e cobre as células. Polo contrario, bacterias como Escherichia coli poden cultivarse en medios sólidos ou líquidos.

Unha importante distinción entre tipos de medios de cultivo é dividilos en medios definidos e non definidos.^[1]

Un medio definido ou quimicamente definido contén cantidades coñecidas de cada un dos seus ingredientes. Para o cultivo de microorganismos, estes medios proporcionan elementos traza e vitaminas requiridas polo microbio e unhas fontes de carbono e de nitróxeno especialmente definidas. A glicosa ou o glicerol úsanse ás veces como fontes de carbono, e os sales de amonio ou nitratos como fontes de nitróxeno inorgánicas.
Un medio non definido ou complexo ten algúns ingredientes complexos, como extracto de lévedo, carne ou soia ou hidrolizado de caseína, que constan dunha mestura de moitas especies químicas en proporcións descoñecidas. Os medios non definidos son os elixidos ás veces polo seu prezo e outras por necesidade, xa que algúns microorganismos nunca puideron ser cultivados en medios definidos.

Un bo exemplo de medio de cultivo é o mosto utilizado para fabricar cervexa. O mosto contén todos os nutrientes requiridos para o cultivo de lévedos, e en condicións anaeróbicas, prodúcese neles alcohol. Cando o proceso de fermentación está completo, a combinación de medio e microbios dormentes, que é a cervexa, está lista para o seu consumo.

Exemplo (composición do medio de ágar nutriente): Extracto de carne- 0,3gm (minerais e carbohidratos). Peptona- 0,5gm (proteínas e fonte de nitróxeno). NaCl- 0,5gm (electrólito). Ágar- 1,5gm (axente solidificante). Auga destilada- 100 mL. pH- 7.

Medios nutritivos xerais

Os medios nutritivos xerais conteñen todos os elementos que moitas bacterias necesitan para crecer e non son selectivos, polo que se utilizan para o cultivo xeral e mantemento das bacterias conservadas en coleccións de cultivos de laboratorio. As bacterias esixentes que teñan requirimentos especiais requiriran medios con ingredientes adicionais (determinados nutrientes orgánicos, factores de crecemento etc.). Hai medios de cultivo definidos e non definidos.

Medios mínimos

Os medios mínimos son os que conteñen os nutrientes mínimos posibles para ocrecemento da colonia, xeralmente sen aminoácidos. Utilízanos os microbiólogos e xenetistas para cultivar microorganismos do "tipo salvaxe" (os máis comúns desa especie, sen mutacións especiais características). Os medios mínimos poden tamén utilizarse para seleccionar a favor ou en contra recombinantes ou exconxugantes.

O medio mínimo normalmente contén:

Unha fonte de carbono para o crecemento bacteriano, que pode ser un azucre como a glicosa, ou unha fonte menos rica en enerxía como o succinato.
Varios sales, que poden variar dunha especie bacteriana a outra e segundo as condicións de crecemento; estes xeralmente proporcionan elementos esenciais como o magnesio, nitróxeno, fósforo, e xofre, que lle permitirán á bacteria sintetizar proteínas e ácidos nucleicos.
Auga.

Os medios mínimos suplementarios son un tipo de medios mínimos que tamén conteñen un só axente seleccionado, xeralmente un aminoácido ou un azucre. Esta suplementación permite o cultivo de liñas específicas de recombinantes auxotróficos.

Medios selectivos

Medio ágar selectivo baseado en carbón vexetal libre de sangue (CSM) para o illamento de Campylobacter.

As placas de ágar sangue son a miúdo utilizadas para diagnosticar infección. Á dereita un cultivo de Streptococcus positivo; á esquerda un cultivo de Staphylococcus positivo.

Catro tipos de placas de ágar nas que se demostra o crecemento diferencial dependendo do metabolismo bacteriano.

Os medios selectivos utilízanse para cultivar só microorganismos seleccionados. Por exemplo, se un microorganismo é resistente a certos antibióticos, como a ampicilina ou a tetraciclina, despois pode engadirse ese antibiótico ao medio para impedir que crezan outras células que non posúen esa resistencia. Os medios que carecen dun aminoácido como a prolina xunto con cepas de E. coli que non poden sintetizala eran utilizados comunmente polos xenetistas antes da emerxencia da xenómica para facer mapas dos cromosomas bacterianos.

Os medios de cultivo selectivos tamén se utilizan en cultivos celulares para asegurar a supervivencia ou proliferación de células con certas propiedades, como a resistencia a antibióticos ou a capacidade de sintetizar certos metabolitos. Normalmente, a presenza dun xene específico ou dun alelo dun xene confírelle á célula a capacidade de crecer nun medio selectivo. En tales casos, o xene denomínase marcador.

Os medios de crecemento selectivo para células eucariotas xeralmente conteñen neomicina para seleccionar células que foron transfectadas con éxito cun plásmido que leva o xene de resistencia á neomicina como marcador. O gancyclovir é unha excepción á regra, xa que se usa para matar especificamente células que leven o seu marcador respectivo, que é a timidina quinase de virus herpes simplex (HSV TK).

Algúns exemplos de medios selectivos son:

Azul de metileno eosina (EMB), que contén azul de metileno, que é tóxico para as bacterias grampositivas, e só deixa crecer ás gramnegativas.
Medio selectivo YM (do inglés yeast and mold, lévedo e mofo), que ten un pH baixo, que dificulta o crecemento bacteriano.
Ágar MacConkey para bacterias gramnegativas.
Ágar entérico Hektoen (HE), que é selectivo para bacterias gramnegativas.
Ágar manitol sal (MSA), que é selectivo para bacterias grampositivas e diferencial para o manitol.
Caldo formidable (Terrific Broth, TB), utilizado con glicerol en cepas recombinantes en cultivo de Escherichia coli.
Ágar xilosa lisina desoxicolato (XLD), que é selectivo para bacterias gramnegativas.
Ágar de extracto de lévedo carbón vexetal tamponado, que é selectivo para certas bacterias gramnegativas, especialmente Legionella pneumophila.

Medios diferenciais

Os medios diferenciais ou medios indicadores serven para distinguir un tipo de microorganismo doutro ao cultivalos no mesmo medio.^[5] Este tipo de medios utiliza as características bioquímicas dun microorganismo que crece en presenza de nutrientes específicos ou indicadores (como o vermello neutro, vermello fenol, eosina y, ou azul de metileno), que foron engadidos ao medio para indicar visiblemente as características definitorias dun microorganismo. Este tipo de medios úsase para a detección de microorganismos e polos biólogos moleculares para detectar cepas recombinantes de bacterias.

Exemplos de medios diferenciais son:

Ágar sangue (utilizado en probas de detección de Streptococcus do grupo A), que contén sangue de corazón de vaca que se volve transparente en presenza de estreptococos hemolíticos.
Azul de metileno eosina (EMB), que é diferencial para a fermentación de lactosa e sacarosa.
MacConkey (MCK), que é diferencial para a fermentación da lactosa.
Ágar manitol sal (MSA), que é diferencial para a fermentación do manitol.
Placas X-gal, que son diferenciais para os mutantes para o operón lac.

Medios de transporte

Os medios de cultivo de transporte deben cumprir os seguintes criterios:

Almacenar temporalmente mostras que van ser transportadas ao laboratorio para o seu cultivo.
Manter a viabilidade de todos os organismos da mostra sen alterar a súa concentración.
Conter só tampóns e sal.
Carecer de fontes de carbono e nitróxeno e factores de crecemento orgánicos para así impedir a multiplicación microbiana.
Os medios de transporte utilizados para o illamento de organismos anaerobios deben estar libres de oxíxeno molecular.

Exemplos de medios de transporte son:

Caldo de tioglicolato para organismos anaerobios estritos.
Medio de transporte Stuart, un xel de ágar brando non nutritivo, que contén un axente redutor para impedir a oxidación e carbón vexetal para neutralizar.
Certos inhibidores bacterianos para gonococos, e glicerol salino tamponado para os bacilos entéricos.
Medio de Venkat-Ramakrishnan (VR) para o Vibrio cholerae.

Medios enriquecidos

Os medios enriquecidos conteñen os nutrientes necesarios para manter o crecemento dunha ampla variedade de organismos, incluíndo algúns dos que son máis esixentes. Úsanse xeralmente para cultivar todos os tipos de microbios que estean presentes nunha mostra. O ágar sangue é un medio enriquecido no cal o sangue completo nutricionalmente rico complementa os nutrientes básicos. O ágar chocolate está enriquecido con sangue que foi tratada con calor (40-45 °C), o cal fai que se poña de cor castaña ou chocolate.

Notas

↑ ^1,0 ^1,1 ^1,2 Madigan M, Martinko J (editors). (2005). Brock Biology of Microorganisms (11th ed.). Prentice Hall. ISBN 0-13-144329-1.
↑ Birgit Hadeler, Sirkka Scholz, Ralf Reski (1995) Gelrite and agar differently influence cytokinin-sensitivity of a moss. Journal of Plant Physiology 146, 369-371
↑ Ryan KJ, Ray CG (editors) (2004). Sherris Medical Microbiology (4th ed.). McGraw Hill. ISBN 0-8385-8529-9.
↑ Cooper GM (2000). "Tools of Cell Biology". The cell: a molecular approach. Washington, D.C: ASM Press. ISBN 0-87893-106-6.
↑ Washington JA (1996). "Principles of Diagnosis". Baron's Medical Microbiology (Baron S et al., eds.) (4th ed.). Univ of Texas Medical Branch. ISBN 0-9631172-1-1.

Véxase tamén

Outros artigos

Ligazóns externas

[Brock-1] 1,0 ^1,1 ^1,2 Madigan M, Martinko J (editors). (2005). Brock Biology of Microorganisms (11th ed.). Prentice Hall. ISBN 0-13-144329-1.

[2] Birgit Hadeler, Sirkka Scholz, Ralf Reski (1995) Gelrite and agar differently influence cytokinin-sensitivity of a moss. Journal of Plant Physiology 146, 369-371

[Sherris-3] Ryan KJ, Ray CG (editors) (2004). Sherris Medical Microbiology (4th ed.). McGraw Hill. ISBN 0-8385-8529-9.

[4] Cooper GM (2000). "Tools of Cell Biology". The cell: a molecular approach. Washington, D.C: ASM Press. ISBN 0-87893-106-6.

[Baron-5] Washington JA (1996). "Principles of Diagnosis". Baron's Medical Microbiology (Baron S et al., eds.) (4th ed.). Univ of Texas Medical Branch. ISBN 0-9631172-1-1.

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]