Gráfica de Lineweaver-Burk

En bioquímica, a gráfica de Lineweaver–Burk, representación de Lineweaver-Burk ou gráfica da dobre recíproca é unha representación gráfica da cinética encimática que presentan os encimas que seguen a ecuación de Michaelis–Menten, que foi descrita por Hans Lineweaver e Dean Burk en 1934.^[1] É unha gráfica liñal en lugar dunha curva.

A gráfica da dobre recíproca distorsiona a estrutura dos erros dos datos, e non é, polo tanto, a ferramenta máis axeitada para a determinación dos parámetros da cinética encimática.^[2] Aínda que a gráfica de Lineweaver–Burk foi utilizada historicamente para a avaliación dos parámetros da ecuación de Michaelis–Menten, xunto coas formas liñais alternativas de representar os datos, como a gráfica de Hanes–Woolf ou a de Eadie–Hofstee, todas as formas linearizadas da ecuación de Michaelis–Menten deberían evitarse para calcular os parámetros cinéticos. Os métodos de regresión non liñal debidanmente ponderados son significativamente máis exactos e agora son doadamente accesibles coa dispoñibilidade universal dos computadores de escritorio.

Definicións

A representación de Lineweaver–Burk deriva da transformación da ecuación de Michaelis–Menten,

v={\frac {Va}{K_{\mathrm {m} }+a}}

na cal a velocidade $v$ é unha función da concentración de substrato $a$ e de dous parámetros: $V$ , a velocidade limitante e $K_{\mathrm {m} }$ , a constante de Michaelis. Tomando as recíprocas en ambos os membros da ecuación queda así:

{\frac {1}{v}}={\frac {1}{V}}+{\frac {K_{\mathrm {m} }}{V}}\cdot {\frac {1}{a}}

Así a gráfica de $1/v$ fronte a $1/a$ xera unha liña recta que corta o eixe de ordenadas en $1/V$ , e o de abscisas en $-1/K_{\mathrm {m} }$ e ten unha pendente de $K_{\mathrm {m} }/V$ .

Aplicacións

Representación da dobre recíproca en diferentes tipos de inhibición.

Cando se usa para determinar o tipo de inhibición encimática, a representación de Lineweaver–Burk pode distinguir entre inhibidores competitivos, non-competitivos puros, incompetitivos (ou acompetitivos) e mixtos. Os diversos modos de inhibición poden compararse coa reacción non inhibida.

Inhibición competitiva

O valor aparente de $V$ non é afectado polos inhibidores competitivos. Polo tanto, os inhibidores competitivos teñen o mesmo punto de corte no eixe de ordenadas que os encimas non inhibidos.

A inhibición competitiva incrementa o valor aparente de $K_{\mathrm {m} }$ , ou diminúe a afinidade do substrato. Graficamente, isto pode verse como que o encima inhibido ten un punto de corte na abscisa nun valor maior.

Inhibición non-competitiva pura

Na inhibición non-competitiva pura o valor aparente de $V$ diminúe. Isto pode verse na gráfica de Lineweaver–Burk como un punto de corte en ordenadas de maior valor, pero non ten ningún efecto no punto de corte en abscisas $-1/K_{\mathrm {m} }$ , xa que a inhibición non-competitiva pura non afecta a afinidade do substrato.

Inhibición mixta

A inhibición non-competitiva pura é rara, mentres que a inhibición mixta é moito máis común. Na inhibición mixta o valor aparente de $V$ diminúe, e o de $K_{\mathrm {m} }$ cambia, xeralmente aumentando, o que significa que a afinidade adoita diminuír na inhibición mixta.

Cleland recoñeceu que a inhibición non-competitiva era moi rara na práctica, e aparecía principalmente cos efectos de protóns e algúns ións metálicos, e redefiniu non-competitiva para que significase mixta.^[3] Porén, aínda que moitos autores aceptaron este cambio, non todos o fixeron.

Inhibición incompetitiva

O valor aparente de $V$ diminúe na inhibición incompetitiva (tamén chamada acompetitiva), co de $V/K_{\mathrm {m} }$ . Isto pode verse na gráfica de Lineweaver–Burk como un incremento do valor do punto de corte en ordenadas, sen cambio na pendente (orixínanse liñas paralelas).

A afinidade do substrato increméntase coa inhibición incompetitiva, ou diminúe o valor aparente de $K_{\mathrm {m} }$ . Graficamente, a inhibición incompetitiva pode identificarse porque están representadas liñas parlelas para as diferentes concentracións de inhibidor.

Limitacións

A representación de Lineweaver–Burk non fai un bo traballo á hora de visualizar os erros experimentais.^[4] Concretamente, se os erros $\varepsilon (v)$ teñen erros estándar uniformes, entón os de $1/v$ varían nun moi amplo rango, como se pode ver no seguinte exemplo:

Se

v=1\pm 0,1

entón o rango de

1/v

é 0,91–1,11, aproximadamente o 20 %.

Se

v=10\pm 0,1

(mesma desviación estándar) entón o rango de

1/v

é 0,0990–0,1001, aproximadamente o 1 %.

Lineweaver e Burk eran conscientes deste problema e despois de investigaren o ero de distribución experimentalmente,^[5] atopando unha desviación estándar uniforme en $v$ , eles consultaron o eminente estatístico W. Edwards Deming.^[6] Á luz do seu consello, utilizaron ponderacións de $v^{4}$ para axustaren a súa $1/v$ . Este aspecto do artigo que publicaron non sempre se ten en conta cando se explica o "método de Lineweaver e Burk."

Os valores medidos a unha baixa $a$ , e, polo tanto, os valores grandes de $1/a$ orixinan puntos situados moi á dereita na gráfica e teñen un grande efecto sobre a pendente da liña, e así, en particular, sobre o valor de $K_{\mathrm {m} }$ .

Notas

↑ Lineweaver, Hans; Burk, Dean (marzo de 1934). "The Determination of Enzyme Dissociation Constants". Journal of the American Chemical Society (en inglés) 56 (3): 658–666. ISSN 0002-7863. doi:10.1021/ja01318a036.
↑ Greco, W. R.; Hakala, M. T. (1979-12-10). "Evaluation of methods for estimating the dissociation constant of tight binding enzyme inhibitors". The Journal of Biological Chemistry 254 (23): 12104–12109. ISSN 0021-9258. PMID 500698. doi:10.1016/S0021-9258(19)86435-9.
↑ Cleland, W. W. "The kinetics of enzyme-catalyzed reactions with two or more substrates or products: II. Inhibition: Nomenclature and theory". Biochim. Biophys. Acta 67 (2): 173–187. doi:10.1016/0926-6569(63)90226-8.
↑ Dowd, John E.; Riggs, Douglas S. (febreiro de 1965). "A Comparison of Estimates of Michaelis-Menten Kinetic Constants from Various Linear Transformations". Journal of Biological Chemistry 240 (2): 863–869. ISSN 0021-9258. doi:10.1016/s0021-9258(17)45254-9.
↑ Burk, D. "Nitrogenase". Ergebnisse der Enzymforschung 3: 23–56.
↑ Lineweaver H, Burk D, Deming, W E (1934). "The dissociation constant of nitrogen-nitrogenase in Azobacter". J. Amer. Chem. Soc. 56: 225–230. doi:10.1021/ja01316a071.

Véxase tamén

Outros artigos

Ligazóns externas

Guia dos NIH, desenvolvemento de ensaios de encimas e análises

[1] Lineweaver, Hans; Burk, Dean (marzo de 1934). "The Determination of Enzyme Dissociation Constants". Journal of the American Chemical Society (en inglés) 56 (3): 658–666. ISSN 0002-7863. doi:10.1021/ja01318a036.

[2] Greco, W. R.; Hakala, M. T. (1979-12-10). "Evaluation of methods for estimating the dissociation constant of tight binding enzyme inhibitors". The Journal of Biological Chemistry 254 (23): 12104–12109. ISSN 0021-9258. PMID 500698. doi:10.1016/S0021-9258(19)86435-9.

[3] Cleland, W. W. "The kinetics of enzyme-catalyzed reactions with two or more substrates or products: II. Inhibition: Nomenclature and theory". Biochim. Biophys. Acta 67 (2): 173–187. doi:10.1016/0926-6569(63)90226-8.

[dowd-4] Dowd, John E.; Riggs, Douglas S. (febreiro de 1965). "A Comparison of Estimates of Michaelis-Menten Kinetic Constants from Various Linear Transformations". Journal of Biological Chemistry 240 (2): 863–869. ISSN 0021-9258. doi:10.1016/s0021-9258(17)45254-9.

[Ergeb-5] Burk, D. "Nitrogenase". Ergebnisse der Enzymforschung 3: 23–56.

[6] Lineweaver H, Burk D, Deming, W E (1934). "The dissociation constant of nitrogen-nitrogenase in Azobacter". J. Amer. Chem. Soc. 56: 225–230. doi:10.1021/ja01316a071.

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]