Taq polimerase
O encima Taq polimerase (ou ADN polimerase Taq), abreviada como "Taq Pol" ou simplemente "Taq", é unha ADN polimerase termoestable (non se desnaturaliza a altas temperaturas) que procede da bacteria termófila Thermus aquaticus e que se usa moito no laboratorio na técnica da PCR, un método para amplificar a cantidade de curtos segmentos de ADN. Foi illada da mencionada bacteria en 1965 por Thomas D. Brock.[1]
| Taq polimerase | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
 ADN polimerase unida a un octámero de ADN | |||||||||
| Identificadores | |||||||||
| Símbolo | Taq-exonuc | ||||||||
| Pfam | PF09281 | ||||||||
| InterPro | IPR015361 | ||||||||
| SCOPe | 1qtm / SUPFAM | ||||||||
| |||||||||
| Taq polimerase | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
 ADN polimerase | |||||||||
| Identificadores | |||||||||
| Símbolo | Taq-exonuc | ||||||||
| Pfam | PF09281 | ||||||||
| InterPro | IPR015361 | ||||||||
| SCOPe | 1qtm / SUPFAM | ||||||||
| |||||||||
T. aquaticus é unha bacteria que vive en fontes termais. A Taq polimerase foi identificada[1] como un encima que pode resistir as condicións normalmente desnaturalizantes (como a alta temperatura) utilizadas durante a PCR.[2] Este encima substituíu a ADN polimerase de Escherichia coli, que era a que se usaba orixinalmente na PCR, que é moito menos resistente.[3] A temperatura óptima para a Taq polimerase é de 75–80 °C, cunha vida media maior de 2 horas a 92,5 °C, e de 40 minutos a 95 °C, e de 9 minutos a 97,5 °C, e pode replicar unha cadea de ADN de 1000 pares de bases en menos de 10 segundos a 72 °C.[4]
Unha das desvantaxes da Taq é a súa relativamente baixa fidelidade de replicación. A Taq natural carece de actividade exonuclease 3'-5' de corrección de erros (proofreading),[4] e ten unha taxa de erro de arredor de 1 de cada 9.000 nucleótidos.[5][6] Illáronse algunhas outras ADN polimerases termoestables doutras bacterias termofílicas e arqueas, como a ADN polimerase Pfu, que si teñen actividade de corrección de erros, e úsanse en lugar (ou en combinación) da Taq para facer unha amplificación de maior fidelidade.
A Taq polimerase orixina produtos de ADN nos que sobresae polos seus extremos 3' adenina (A). Isto pode ser útil para a clonación TA, polo que e uitiliza un vector de clonación (como un plásmido) do que sobresae unha timina (T) en 3', que se complementa coa A que sobresae do produto da PCR, o que permite a ligación do produto da PCR no plásmido vector.
Probáronse diversas modificacións provocadas na Taq polimerase para mellorar o seu rendemento.[7]
A Taq polimerase na PCR editar
A comezos da década de 1980, Kary Mullis estaba traballando na aplicación de ADNs sintéticos á biotecnoloxía. Tiña traballado con oligonucleótidos de ADN, que se usaban como sondas que se unían a fibras de ADN diana, ou se usaban como cebadores para a secuenciación do ADN e na síntese de ADNc. En 1983, empezou a usar dous cebadores, un para hibridarse a cada fibra dun ADN diana, e engadiu ADN polimerase á reacción. Isto deu lugar a unha replicación do ADN expoñencial,[8] que amplificou enormente as cantidades de ADN entre os cebadores.[3]
Porén, despois de cada rolda de replicación a mestura tiña que ser quentada por riba dos 90 °C para desnaturalizar o ADN acabado de formar, é dicir, para que se separasen as súas dúas cadeas e puidesen actuar como moldes na seguinte rolda de amplificación. Este paso de elevación da temperatura inactivaba a ADN polimerase I de E. coli (fragmento de Klenow) que se usaba antes do descubrimento da Taq polimerase.
O uso da Taq polimerase termoestable evita a necesidade de ter que engadir novos encimas (non desnaturalizados) á reacción da PCR durante o proceso de termociclado. O proceso enteiro pode levarse a cabo nun simple tubo pechado nunha máquina relativamente simple (termociclador). Deste xeito, o uso da Taq polimerase foi a idea chave que fixo que a PCR fose aplicable a unha gran variedade de problemas e experimentos de bioloxía molecular que tiñan que ver coa análise do ADN.[2]
Patentes editar
As patentes da PCR e Taq pertencían a Cetus Corporation na que estaba traballando Hary Mullis. Finalmente, Hoffmann-La Roche comprou as patentes da PCR e Taq a Cetus por 330 millóns de dólares, e por elas chegaría despois a recibir 2.000 millóns en dereitos.[9] En 1989, a revista Science elixiu á Taq polimerase como a súa primeira "molécula do ano". Kary Mullis recibiu o Premio Nobel de Química en 1993, o único que se outorgou por unha investigación realizada nunha empresa privada de biotecnoloxía. A comezos da década de 1990, a técnica da PCR co uso da Taq polimerase utilizábase en moitas áreas, como a investigación básica en bioloxía molecular, probas clínicas, e forenses. Posteriormente empezou a usarse na detección do VIH, virus causante da SIDA.[10]
A compañía Hoffman-La Roche foi demandada nos tribunais por Promega corporation por problemas coa patente. En 1999 os tribunais ditaminaron que a patente de 1990 que implicaba a Taq polimerase emitiuse en parte debido a información enganosa e afirmacións falsas dos científicos de Cetus Corporation, o que daba a razón ao demandante. O xuíz citou descubrimentos previos realizados por outros laboratorios, como o laboratorio de John Trela na Universidade de Cincinnati.[11]
Notas editar
- ↑ 1,0 1,1 Chien A, Edgar DB, Trela JM (1976). "Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus". J. Bact. 127 (3): 1550–7. PMC 232952. PMID 8432.
- ↑ 2,0 2,1 Saiki, RK; et al. (1988). "Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.". Science 239 (4839): 487–91. PMID 2448875. doi:10.1126/science.239.4839.487.
- ↑ 3,0 3,1 Saiki, RK; et al. (1985). "Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia". Science 230 (4732): 1350–4. PMID 2999980. doi:10.1126/science.2999980. Arquivado dende o orixinal o 19 de decembro de 2008. Consultado o 12 de xullo de 2013.
- ↑ 4,0 4,1 Lawyer FC; et al. (1993). "High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase ...". PCR Methods Appl. 2 (4): 275–87. PMID 8324500.
- ↑ Tindall KR and Kunkel TA (1988). "Fidelity of DNA synthesis by the Thermus aquaticus DNA polymerase". Biochemistry 27 (16): 6008–13. PMID 2847780. doi:10.1021/bi00416a027.
- ↑ Bu Z, Biehl R, Monkenbusch M, Richter D, Callaway DJ (2005). "Coupled protein domain motion in Taq polymerase revealed by neutron spin-echo spectroscopy". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (49): 17646–51. PMC 1345721. PMID 16306270. doi:10.1073/pnas.0503388102.
- ↑ Li Y, Mitaxov V, Waksman G (1999). "Structure-based design of Taq DNA polymerases with improved properties of dideoxynucleotide incorporation". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (17): 9491–6. PMC 22236. PMID 10449720.
- ↑ Mullis KB (1990). "The unusual origin of the polymerase chain reaction". Sci. Am. 262 (4): 56–61, 64–5. PMID 2315679. doi:10.1038/scientificamerican0490-56.
- ↑ Fore J, Wiechers IR, Cook-Deegan R (2006). "The effects of business practices, licensing, and intellectual property on development and dissemination of the polymerase chain reaction: case study". J Biomed Discov Collab 1: 7. PMC 1523369. PMID 16817955. doi:10.1186/1747-5333-1-7.
Detailed history of Cetus Corporation and the commercial aspects of PCR. - ↑ Guatelli JC, Gingeras TR, Richman DD (1 April 1989). "Nucleic acid amplification in vitro: detection of sequences with low copy numbers and application to diagnosis of human immunodeficiency virus type 1 infection". Clin. Microbiol. Rev. 2 (2): 217–26. PMC 358112. PMID 2650862.
- ↑ "Curran, Chris, Bio-Medicine, Dec. 7, 1999". Arquivado dende o orixinal o 03 de marzo de 2016. Consultado o 12 de xullo de 2013.
Véxase tamén editar
Outros artigos editar
| Commons ten máis contidos multimedia sobre: Taq polimerase |