ELISA: Diferenzas entre revisións
Contido eliminado Contido engadido
Liña 39:
== Tipos ==
<!--▼
=== ELISA directo ===
[[Ficheiro:ELISA diagram.png|esquerda|200px|miniatura|Diagrama do ELISA directo.]]
Liña 50:
*Canto maior é a concentración do anticorpo primario presente no soro, máis forte é o cambio de cor. Xeralmente utilízase un espectrómetro para dar os valores cuantitativos da forza da cor.
O encima actúa como un amplificador, xa que as moléculas de encima producirán moitas moleculas sinal aínda que só permanezan unidos uns poucos anticorpos ligados a encima. Coas limitación de sentido común, o encima pode continuar producindo cor indefinidamente, pero cantomáis anticorpo haxa unido, máis rápido se producirá a cor. Unha importante desvantaxe do ELISA directo é que o método de inmobiliación do antíxeno non é esècífico; canso se usa soro sanguíneo como fonte de antíxeno, todas as proteínas da mostra pode adherirse ao pozo da placa microtitradora, polo que pequenas concentracións de analito no soro deben competir con outras proteínas do soro á hora de unirse á superficie dopozo. O ELISAindirecto ou sandwich dá unha solución a este problema, ao usar un anticorpo de "captura" específico para o antíxeno que vai ser comprobado para retiralo da mestura molecular do soro.
O ELISA pode realizarse en formato cualitativo ou cuantitativo. Os resultados cualitativos proporcionan un simple resultado positivo ou negativo (de si ou non) para a mostra. O límite para discernir entre un positivo e un negativo é determinado polo analista e pode ser estatístico. A miúdo utilízase un límite que está en dús ou tres veces a desviación típica (erro inherent nunha prob) para distinguir entre mostras positivas e negativas. No ELISA cuantitativo, a densidade óptica da mostra compárase cunhacurva estándar, que é normalmente unha dilución seriada dunha solución de concentración coñecida da molécula diana. Por exemplo, se unha proba dunha mostra dá unha densidade óptica de 1,0, opunto na curva estándar que dá unha densidade óptica de 1,0 debe ter a mesma concentración de analito que a mostra.
O uso e significado das denominacións "ELISA directo" e "ELISA indirecto" difiren na literatura e en sitios web dependendo do contextodo experimento. Cando se analiza a presenza dun antíxeno, o nome "ELISA directo" significa un ELISA no cal se usou só un anticorpoprimario marcado, e o termo "ELISA indirecto" indica un ELISA no cal o antíxeno está unido ao anticorpo primario que se detecta despois por mediodun anticorposecundario marcado. Neste último caso un ELISA sandwich é claramente distinto dun ELISA indiecto. Cando interesa o anticorpo "primario", por exemplo no caso de análises de inmunizacion, este anticorpo detéctase directamente polo anticorpo secundario e o termo "ELISA directo" aplícase a un escenario con dous anticorpos.
=== ELISA sandwich ===
▲<!--
[[Ficheiro:ELISA-sandwich.svg|miniatura|300px|'''Un ELISA sandwich'''. (1) A placa cóbrese cun anticorpode captura; (2) engádese a mostra, e calquera molécula de antíxenopresente únese ao anticorpode captura; (3) engádese o anticorpode detección, que se une ao antíxeno; (4) adiciónase o anticorpo secundario ligado a encima, que se une ao anticorpo de detección; (5) engádese osubstrato, que é convertido poloencima nunha forma detectable.]]
A "sandwich" E.L.I.S.A, is used to detect sample antigen. The steps are:
Liña 87 ⟶ 88:
For the detection of HIV antibodies, the wells of microtiter plate are coated with the HIV antigen. Two specific antibodies are used, one conjugated with enzyme and the other present in serum (if serum is positive for the antibody). Cumulative competition occurs between the two antibodies for the same antigen, causing a stronger signal to be seen. Sera to be tested are added to these wells and incubated at 37 °C, and then washed. If antibodies are present, the antigen-antibody reaction occurs. No antigen is left for the enzyme-labelled specific HIV antibodies. These antibodies remain free upon addition and are washed off during washing. Substrate is added, but there is no enzyme to act on it, so positive result shows no color change.
-->▼
== Aplicacións ==
[[Ficheiro:ELISA.jpg|miniatura|dereita|ELISA sandwich de anticorpo dobre anti-IgG humana.]]
Liña 94 ⟶ 95:
O ELISA foi o primeiro test de screening que se usou xeneralizadamente para o [[VIH]] debido á súa alta sensibilidade. Nun ELISA, o [[soro sanguíneo]] dunha persoa dilúese 400 veces e aplicada a unha placa á cal están unidos os antíxeno do VIH. Se os anticorpos do VIH están presentes no soro, poden unirse a estes antíxenos de VIH. Despois, lávase a placa para eliminar todos os outros compoñentes do soro. Despois aplícase á placa un "anticorpo secundario" especialmente preparado (é dicir, un anticorpo que se une a outro anticorpo), seguido doutro lavado. Este anticorpo secundario é ligado quimicamente previamente a un encima.
Así, placa contén encima en proporción á cantidade de anticorpo secundario unido á placa. Aplícse un substratopara oencima, e a catálise polo encima produce un cambio de cor ou fluorescencia. Os resultados do ELISA indícanse numericamente; o aspecto máis controvertido desta proba é determinar o punto límite pra distinguir os resultados positivos dos negativos.
O punto límite pode determinarse comparándoo cun estándar coñecido. Se se utiliza unha proba de ELISA para un screening de drogas no lugar de traballo, establécese unha concentración límite de 50 ng/ml, por exemplo, e prepárase unha mostra que contén a concentración estándar de analito. Os descoñecidos que xeran un sinal máis forte que a mostra coñecida son considerados "positivos", e os que xeran un sinal máis feble son "negativos".
O Dr. Dennis E. Bidwell
*
*
* detección de marcadores de hepatite B no soro.
*
* detección de anticorpos para o [[VIH]] en mostras de [[sangue]].
▲-->
== Notas ==
| |||