As plantas con fotosíntese C<sub>4</sub> antes do ciclo de Calvin realizan reaccións nas que incorporan o CO<sbsub>2</sub> atmosférico en compostos de 4 carbonos como o [[malato]] e o [[aspartato]]. En reaccións posteriores, o malato e o aspartato descompóñense desprendendo CO<sub>2</sub>, que entra no ciclo de Calvin, polo que hai unha fixación de carbono previa, e, depois, unha segunda fixación no ciclo de Calvin na que intervén a RubisCO. As plantas C<sub>4</sub> teñen unha anatomía das follas especial. A fixación inicial ten lugar nas células do mesófilo das follas, e a fixación final no ciclo de Calvin ten lugar nas células da vaíña vascular que rodea os vasos condutores das follas (nervios). Son exemplos de plantas C<sub>4</sub> moitas plantas tropicasi como a [[cana de azucre]] e o [[millo]]. En total existen unhas 7.600 especies de plantas terrestres que fan unha fixación do carbono C<sub>4</sub>, que supoñen o 3% de todas as especies de plantas.<ref name="Sage99">
{{cite book |editor=Sage RF, Monson RK |author=Sage RF, Meirong L, Monson RK |title=C4 Plant Biology |year=1999 |pages=551–580 |chapter=16. The Taxonomic Distribution of C4 Photosynthesis |isbn=0-12-614440-0}}
</ref> Estas plantas teñen unha sinatura de [[isótopo]]s do carbono de -16 a -10 ‰,<ref name="O'Leary88"/> e son máis eficientes facendo a fotosíntese en climas cálidos, xa que evitan a fotorrespiración ao manteren unha concentración elevada de CO<sub>2</sub> na vaíña vascular.
