Amplicón

Un molde de secuencia de amplicón que foi preparada para a amplificación. A secuencia diana que vai ser amplificada está en verde.

En bioloxía molecular, un amplicón é un segmento de ADN ou ARN que é a fonte e/ou produto de eventos de amplificación ou replicación. Pode formarse artificialmente usando varios métodos, como a reacción en cadea da polimerase (PCR) ou a reacción en cadea da ligase (LCR), ou de maneira natural por duplicación xénica. Neste contexto, amplificación refírese á produción dunha ou máis copias dun fragmento xenético ou secuencia diana, especificamente o amplicón. Como se refire ao produto dunha reacción de amplificación, o termo amplicón utilízase indistintamente xunto con outros termos de laboratorio comúns como "produto de PCR".

A amplificación artificial utilízase en investigación,[1] ciencia forense,[2] e medicina[1] para propósitos como a detección e cuantificación de axentes infecciosos,[3] identificación de restos humanos,[4] e extraer xenotipos dun cabelo humano.[2]

A duplicación xénica natural xoga un importante papel na evolución. Tamén está implicada en varias formas de cancro humano, como o linfoma de células B mediastinal primario e o linfoma de Hodgkin.[5] Neste contexto o termo amplicón pode referirse tanto á sección do ADN cromosómico que foi escindido, amplificado e reinserido noutro lugar no xenoma coma ao fragmento de ADN extracromosómico coñecido como diminuto dobre (double minute), cada un dos cales pode estar composto por un ou máis xenes. A amplificación dos xenes codificados por estes amplicóns xeralmente incrementa a transcrición destes xenes e finalmente o volume de proteínas asociadas.[6]

EstruturaEditar

En xeral os amplicóns son repeticións directas (cabeza-cola) ou repeticións invertidas (cabeza-cabeza ou cola-cola) de secuencias xenéticas, e poden ser de estrutura linear ou circular.[7] Os amplicóns circulares consisten en duplicacións invertidas imperfectas aneladas en círculo[8] e pénsase que se orixinan a partir de amplicóns lineares precursores.[9]

Durante a amplificación artificial, a lonxitude do amplicón está determinada polos obxectivos experimentais perseguidos.[10]

TecnoloxíaEditar

A análise de amplicóns foi posible grazas ao desenvolvemento de métodos de amplificación como a PCR e cada vez máis por tecnoloxías máis baratas e de maior alto rendemento para a secuenciación de ADN ou secuenciación de seguinte xeración, como a secuenciación de semicondutor de Ion, popularmente denominada pola marca da compañía que a desenvolve, Ion Torrent.[11]

As tecnoloxías de secuenciación de ADN como a secuenciación de seguinte xeración fixeron posible o estudo de amplicóns en bioloxía dos xenomas e xenética, incluíndo a investigación da xenética do cancro,[12] investigación filoxenética e xenética humana.[13] Por exemplo, utilizando o xene do ARNr de 16S, que forma parte de todos os xenomas bacterianos e arqueanos e está moi conservado, poden clasificarse taxonomicamente as bacterias comparando a secuencia amplicón con secuencias coñecidas. Este funciona de xeito similar no dominio dos fungos co xene do ARNr de 18S e coa rexión non codificante ITS1.[14]

Independentemente da aproximación utilizada para amplificar os amplicóns, debe utilizarse algunha técnica para cuantificar o produto amplificado.[15] Xeralmente, estas técnicas incorporan un paso de captura e un paso de detección, aínda que o modo en que se incorporan estas técnicas depende do experimento ou ensaio concreto que se realice.

Son exemplos o Amplicor HIV-1 Monitor Assay (RT-PCR), que ten a capacidade de recoñecer o VIH no plasma sanguíneo; a HIV-1 QT (NASBA), que se utiliza para medir a carga viral no plasma amplificando un segmento do ARN do VIH; e a Amplificación mediada por transcrición, que emprega un ensaio de protección de hibridación para distinguir as infeccións por Chlamydia trachomatis.[15] En cada estratexia están implicados varios pasos de detección e captura para avaliar o produto da amplificación ou amplicón. Coa secuenciación de amplicón son concatenados e secuenciados o alto número de amplicóns diferentes resultantes da amplificación dunha mostra usual. Despois de facer a clasificación do control de calidade, faise por diferentes métodos a contaxe de taxons idénticos que representan as súas respectivas abundancias na mostra.

AplicaciónsEditar

Para determinar o sexo a partir dunha mostra humana pode utilizarse a PCR.[16] O locus de inserción do elemento Alu é seleccionado, amplificado e avaliado en canto ao tamaño do fragmento. O ensaio do sexo utiliza AluSTXa para o cromosoma X, AluSTYa para o cromosoma Y, ou tanto AluSTXa coma AluSTYa para reducir a posibilidade de erro a un valor insignificante. O cromosoma inserido rende un gran fragmento cando se amplifica a rexión homóloga. Os machos distínguense por ter dous amplicóns de ADN, mentres que as femias teñen só un. O kit adaptado para levar a cabo o método inclúe un par de cebadores para amplificar o locus e opcionalmente reactivos da reacción en cadea da polimerase.[17]

Para diagnosticar a tuberculose pode utilizarse a LCR.[18] A secuencia que contén a proteína antíxeno B é a diana de catro cebadores oligonucleótidos, dous para a febra sentido e dúas para a febra antisentido. Os cebadores únense uns ao lado dos outros, formando un segmento de ADN bicatenario que, unha vez separado, pode servir como diana para roldas futuras de replicación. Nese caso o produto pode detectarse por medio de inmunoensaio encimático de micropartículas (MEIA).

NotasEditar

  1. 1,0 1,1 Meyers, Robert A., ed. (1995). Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference. New York, NY: VCH Publishers. pp. 53, 585. ISBN 1-56081-925-1. 
  2. 2,0 2,1 Walsh, PS; Metzger, DA; Higuchi, R (1991). "Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material". BioTechniques 10 (4): 506–13. PMID 1867860. 
  3. Consumer Affairs Branch (2010-08-17). "Roche Amplicor HIV-1 Monitor Test". FDA. Consultado o 2012-10-16. 
  4. Gill, Peter; Ivanov, Pavel L.; Kimpton, Colin; Piercy, Romelle; Benson, Nicola; Tully, Gillian; Evett, Ian; Hagelberg, Erika; Sullivan, Kevin (1994). "Identification of the remains of the Romanov family by DNA analysis". Nature Genetics 6 (2): 130–5. PMID 8162066. doi:10.1038/ng0294-130. 
  5. Rui, Lixin; Emre, N.C. Tolga; Kruhlak, Michael J.; Chung, Hye-Jung; Steidl, Christian; Slack, Graham; Wright, George W.; Lenz, Georg; et al. (2010). "Cooperative Epigenetic Modulation by Cancer Amplicon Genes". Cancer Cell 18 (6): 590–605. PMC 3049192. PMID 21156283. doi:10.1016/j.ccr.2010.11.013. 
  6. Bignell, G. R.; Santarius, T.; Pole, J. C.M.; Butler, A. P.; Perry, J.; Pleasance, E.; Greenman, C.; Menzies, A.; et al. (2007). "Architectures of somatic genomic rearrangement in human cancer amplicons at sequence-level resolution". Genome Research 17 (9): 1296–303. PMC 1950898. PMID 17675364. doi:10.1101/gr.6522707. 
  7. Cohn, Waldo E.; Moldave, Kivie, eds. (1996). Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. Academic Press. pp. 280–287. ISBN 978-0-12-540054-1. 
  8. Grodin, K; Roy, G; Ouellette, M (1996). "Formation of extrachromosomal circular amplicons with direct or inverted duplications in drug-resistant Leishmania tarentolae.". Mol. Cell. Biol. 16 (7): 3587–3595. PMC 231354. PMID 8668175. 
  9. Grodin, K; Küding, C; Roy, G; Ouellette, M (1998). "Linear amplicons as precursors of amplified circles in methotrexate-resistant Leishmania tarentolae.". Nucleic Acids Res. 26 (14): 3372–3378. PMC 147699. PMID 9649621. doi:10.1093/nar/26.14.3372. 
  10. PCR Primer Design Guidelines. Premier Biosoft: Accelerating Research in Life Sciences. Retrieved from: http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/PCR_Primer_Design.html
  11. "Ion Torrent Official Webpage". Arquivado dende o orixinal o 06 de novembro de 2012. Consultado o 2018-10-16. 
  12. International Cancer Genome Consortium Official Website
  13. National Human Genome Research Institute
  14. Usyk, Mykhaylo; Zolnik, Christine P.; Patel, Hitesh; Levi, Michael H.; Burk, Robert D. (2017-12-13). Mitchell, Aaron P., ed. "Novel ITS1 Fungal Primers for Characterization of the Mycobiome". mSphere 2 (6): e00488–17, /msphere/2/6/mSphere0488–17.atom. ISSN 2379-5042. PMC 5729218. PMID 29242834. doi:10.1128/mSphere.00488-17. 
  15. 15,0 15,1 Stanley, J. (2002). Essentials of Immunology & Serology by Jacqueline Stanley. Albany, NY: Delmar.
  16. Mannucci, Armando; Sullivan, Kevin M.; Ivanov, Pavel L.; Gill, Peter (1994). "Forensic application of a rapid and quantitative DNA sex test by amplification of the X-Y homologous gene amelogenin". International Journal of Legal Medicine 106 (4): 190–3. PMID 8038111. doi:10.1007/BF01371335. 
  17. Hedges, Dale J; Walker, Jerilyn A; Callinan, Pauline A; Shewale, Jaiprakash G; Sinha, Sudhir K; Batzer, Mark A (2003). "Mobile element-based assay for human gender determination". Analytical Biochemistry 312 (1): 77–9. PMID 12479838. doi:10.1016/S0003-2697(02)00430-X. 
  18. O'Connor, T M (1 November 2000). "The ligase chain reaction as a primary screening tool for the detection of culture positive tuberculosis". Thorax 55 (11): 955–957. PMC 1745641. PMID 11050266. doi:10.1136/thorax.55.11.955. 

Véxase taménEditar

Outros artigosEditar

BibliografíaEditar

Ligazóns externasEditar

"What is an amplicon? See examples of the different applications.". YouTube video.